玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响

玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响

避免冷卵冷卵的伦理问题，增加卵的来源，并为需要移除卵或延迟繁殖的妇女提供繁殖保险。卵子结构复杂，冷冻极易造成其不可逆的病变甚至死亡，卵母细胞成熟状态也会影响卵子冷冻结果。成熟卵子和未成熟卵因其结构不同，对冷冻的耐受性也不同。理论上，冷冻未成熟GV卵似乎是更好的选择，但是也有报道指出GV卵对冷冻更为敏感。因此本研究结合胚胎学和细胞骨架指标，探讨成熟阶段对卵子冷冻结果的影响以及GV卵冷冻时机的选择。1材料和方法1.1ksom液及ksom液的配制玻璃化冷冻的基础液为含20%胎牛血清（FCS）（北京中杉金桥生物技术有限公司）的磷酸盐缓冲液（PBS），体外成熟液（MEM）为含50μg/ml青霉素、75μg/ml链霉素、0.3mol/L丙酮酸钠、200mmol/L谷氨酰胺、20%FCS、0.075IU/mlFSH及1IU/mlhCG的α-MEM溶液，受精液为含4mg/ml牛血清白蛋白（BSA）的KSOM液，卵裂液为含1mg/mlBSA的KSOM液，KSOM液的配制见文献。除FCS外，其余试剂均来自美国Sigma公司。1.2离体卵片的收集昆明小白鼠，控制光照和黑暗各12h，雌鼠体重20～25g，雄鼠体重30～35g。1.3卵的收集雌鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG）（宁波第二激素厂），10IU/只，44～48h后处死，刺破卵巢表面卵泡，收集生殖泡期（GV）卵置于MEM中，或再注射hCG,5IU/只，16～18h后处死，刺破输卵管的膨大部，收集中期成熟卵（MII）。1.4sops-dmso/dmso添加量冷冻：室温下将卵子在PBS+20%FCS(S)中冲洗2～3次后移入10%乙二醇（EG）+10%二甲基亚砜（DMSO）中停留30s，然后移入20%EG+20%DMSO+0.5mol/L糖中，用SOPS（超薄型开口拉细麦管，MINITUB,Germany）通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。解冻：在室温下依次将卵子移入含0.4mol/L糖、0.2mol/L糖、0.1mol/L糖的S及S中，各停留3min，再于37℃S中停留5min，最后移入MEM中，准备体外培养成熟（IVM）、体外受精（IVF）或固定作免疫荧光标记。1.5IVMGV卵置于MEM中，在CO2培养箱中培养24h后，剥除颗粒细胞，观察到排出第一极体者为MII。1.6单克隆抗体的制备各组MII卵剥除颗粒细胞，予3%多聚甲醛固定，于0.5%TritonX-100(0694,Amresco)中室温下孵化20min，随后依次在37℃下1:100α-微管蛋白单克隆抗体(ZM-0438，北京中杉金桥生物技术有限公司)孵化2h,1:100FITC标记的山羊抗鼠IgG(ZF-0312，北京中杉)避光孵化1.5h,20μg/ml碘化吡啶（PI,ZLI-9038，北京中杉)避光孵化15min，最后以30%甘油装片观察。1.7玻璃化冷冻组的观察分四组，对照组为新鲜GV卵体外培养成熟（IVM）;GV冷冻组为GV卵剥除颗粒细胞后行玻璃化冷冻，解冻后IVM;IVM-MII冷冻组为GV卵IVM，剥除颗粒细胞后观察到第一极体者再行玻璃化冷冻；MII冷冻组为新鲜MII裸卵玻璃化冷冻。1.8统计处理方法2结果2.1正常纺锤体形态复苏卵子存活标准：卵子折光性好，呈透明状，没有明显的胞浆皱缩，透明带与细胞膜都完整。免疫荧光标记观察：正常纺锤体为对称的桶形，且极性存在，可见清晰的丝状微管贯穿两极之间。纺锤体极性消失，纵轴上微管减少或断裂，或纺锤体消失则均认为是异常纺锤体形态。正常染色体紧密地排列在赤道板上，呈线性。异常染色体则结构松散，凝结呈团或模糊不清，单根或部分染色体从赤道板中脱落。2.2两组熟率比较IVM-MII组共获卵313枚，其中体外培养成熟301枚，经玻璃化冷冻解冻后获卵286枚，丢失15枚，丢失率为5%。GV冷冻组、MII冷冻组及IVM-MII冷冻组三组复苏率差异无显著性（P>0.05），见表1。GV冷冻组的成熟率显著低于对照组（P<0.01）。GV冷冻组、MII冷冻组及IVM-MII冷冻组三组受精率均明显低于对照组（P<0.01），且IVM-MII冷冻组受精率显著低于MII冷冻组（P<0.01）。IVM-MII冷冻组囊胚率低于MII冷冻组及对照组，差异均有显著性（28.57%vs52.38%，P<0.05;28.57%vs57.14%，P<0.01），见表2。GV冷冻组染色体、纺锤体及染色体和纺锤体均正常率均高于IVM-MII冷冻组（分别为61.54%vs42.22%和61.54%vs42.22%，P>0.05;53.85%vs26.67%，P<0.05）。IVM-MII冷冻组细胞骨架三项指标均显著低于对照组，且差异均有显著性（P<0.05,P<0.01），见表3。3不同冷冻保护液对冻融gv卵的影响生殖功能保存是目前生殖医学研究的重要方面之一，玻璃化冷冻因其诸多优点越来越受到关注。人类精子库早已建立，并广泛应用。而卵子库尚未建立，这是因为卵子是人体中最大的细胞，其结构复杂，来源少，冷冻难度较大。温度敏感的纺锤体在卵子成熟、受精和卵裂过程中发挥着重要作用。冷冻刺激易造成纺锤体微管的弥散，从而造成染色体的断裂分散，一旦受精，姐妹染色体会因无法联会，引起非整倍体胚胎。理论上，MII期卵子处在成熟分裂的中期，拥有独特的中期纺锤体结构且染色体规则地排列在赤道板上，冷冻更易造成其结构的损伤；而GV卵因尚未形成纺锤体结构且染色体有核膜包围保护，应比MII卵更适合冷冻保存。目前已有冻融GV卵获得成功的报道，但有研究结果与理论不符。Kuleshova等报道冻融人GV卵的受精率和卵裂率（42.9%和16.7%）均远低于冻融MII卵（81%和88%）。李梅等发现冻融人成熟卵和未成熟卵复苏率相近，而前者受精率和卵裂率均高于后者。本研究中GV冷冻组纺锤体正常率、染色体正常率及纺锤体和染色体均正常率都高于MII冷冻组（P>0.05）。MII冷冻组的受精率及囊胚率均略高于GV冷冻组，但两组相比差异无显著性（P>0.05），这与Kuleshova等人的研究结果相似。目前冻融GV卵的体外成熟率与新鲜GV卵大致相当，但随后的胚胎发育潜能却远不及新鲜卵，因此有学者提出细胞浆结构在冷冻损伤中是一个更为关键的因素。因此，目前需要进一步研究如何改进体外培养成熟体系和GV卵冷冻方案以改善GV卵冻融后胞浆成熟，并减少细胞骨架的损伤。未成熟卵是先冷冻还是先培养成熟后再行冷冻，有不同研究结果。小鼠、牛及人研究的结果均表明直接冷冻GV卵结果较IVM-MII卵好，而Rojas等研究结果显示猪IVM-MII卵玻璃化冷冻后纺锤体正常率(25.6%)高于GV期玻璃化冷冻卵(0%)。这些研究结果的差异，可能与使用的冷冻保护液及物种差异有关。本实验玻璃化冷冻小鼠GV卵和IVM-MII卵复苏率相近（65%和69.93%，P>0.05），但IVM-MII冷冻组三项细胞骨架正常率均低于GV冷冻组，和对照组相比，差异有显著性（P<0.05），并且IVM-MII冷冻组受精率和囊胚率均明显低于GV冷冻组。因此本实验结果提示，GV卵先冷冻再复苏后培养成熟似乎更为适宜。这可能是因为冻融