酮康唑对小鼠肝损伤的保护作用

酮康唑对小鼠肝损伤的保护作用

可卡因（cac）是国际上相对猖獗的药物，其滥用已成为一个国际问题。作为滥用的毒品,可卡因在20世纪90年代流入我国,已有中毒死亡的报道。可见,可卡因的走私和滥用问题必须引起足够的重视。有关可卡因毒性的报道主要集中在神经系统和心血管系统,然而,越来越多的临床证据表明,肝脏也是可卡因毒性的一个靶器官。滥用可卡因往往会导致肝功能异常,使肝脏无法发挥正常的生理功能。因此,开发能够拮抗可卡因所致肝脏损伤的药物就显得尤为重要。有报道指出酮康唑(ketoconazole,KT)能够改善可卡因对大鼠行为的影响。然而,在许多临床报告和回顾性研究中,也偶有酮康唑导致的化学性肝损伤的报道。从药物安全性的角度考虑,应该了解酮康唑对可卡因所致的肝损伤方面有何相互影响,也就是研究两种药物之间的相互作用规律,为临床应用提供实验依据。本研究通过动物实验研究酮康唑对肝脏损伤的保护作用,并对药物的作用机制进行初步的探索。1材料和方法1.1还原型谷胱甘肽、gsh和n-乙基顺丁烯二酰亚胺KT,批号为20031207,南京白敬宇制药厂提供,用时以0.5%羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulosesodium,CMC-Na)配成新鲜溶液。Coc,批号20020501,青海制药厂提供,用0.9%生理盐水配制。还原型谷胱甘肽(reducedglutathione,GSH)和N-乙基顺丁烯二酰亚胺(N-ethylmaleimide,NEMI),上海丽珠东风生物技术有限公司出品;氧化型谷胱甘肽(oxidizedglutathione,GSSG):北京红星生化技术公司出品;邻苯二甲醛(O-phthaldehyde,OPT),北京金龙化学试剂有限公司出品。HITACHI-7170A型全自动生化分析仪,Hitachi公司生产;722光栅分光光度计,上海第三分析仪器厂提供。1.2给药、治疗及给药动物的检测ICR小鼠(清洁级),♂,体重23～28g,由北京大学医学部实验动物中心提供。采用预防性和治疗性给药两种方法。在预防性给药实验中,将动物按体重随机分为6组,即溶剂对照组(5%CMC-Na,ig,qd×4d)、可卡因组(5%CMC-Na,ig,qd×4d,于d4给完CMC-Na30min后给予Coc80mg·kg-1,sc)、3个酮康唑预防给药组(KT12.5,25和50mg·kg-1,ig,qd×4d,于d4给完KT30min后给予Coc80mg·kg-1,sc)、酮康唑单独给药组(KT200mg·kg-1,qd×4d,ig),每组5只。在治疗性给药实验中,动物被随机分为5组,即溶剂对照组(5%CMC-Na,ig)、可卡因组(Coc80mg·kg-1,sc)、3个酮康唑治疗给药剂量组(Coc80mg·kg-1,sc,30min后给予KT50,100和200mg·kg-1,ig),每组5只。所有动物在最后处理完成24h后予以脱臼处死,收集血清用于谷丙转氨酶(glutamylpyrubictransaminaes,GPT)、谷草转氨酶(glutamyloxaloacetictransaminase,GOT)和乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)的检测。观察动物肝脏变化并记录动物体重和肝脏重量,计算脏器系数(肝脏/体重),留出部分肝组织用于做光镜HE病理切片进行病理观察。其他组织冷冻到-80℃低温冰箱用于生化分析。1.3谷胱甘肽与谷胱甘肽的配比使用7170A型自动生化分析仪分析血清GPT,GOT和LDH活性(由北京大学第三医院测定)。用改良Hission方法分析谷胱甘肽(reducedglutathione,GSH)和氧化性谷胱甘肽(oxidizedglutathione,GSSG)的含量,并计算两者的比值(GSH/GSSG);肝脏中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量用TAB反应法检测。1.4组织病理学分析部分肝组织用甲醛固定,进行常规石蜡包埋切片,经苏木素和伊红(HE)染色后在光镜观察病理改变。1.5数据统计分析实验数据以x¯±sx¯±s表示。采用SPSS10.0软件,分别按数据情况经假设条件检验进行了方差齐性检验、方差分析、回归分析和成组资料t检验处理等。2结果2.1对肝脏重量的影响由表1结果显示,可卡因模型组小鼠体重、肝脏重量均显著低于溶剂对照组;酮康唑各组与可卡因组相比,体重、肝脏重量略有增加,但无显著性差异。肝体比各组之间未见差异。2.2酮康唑对血清酶活性的影响单独给予可卡因后,血清酶的活性明显升高。与可卡因组比较,酮康唑给药组酶的活性均有有明显的下降,50mg·kg-1组血清酶活性已经接近正常水平(图1)。3可卡因所致肝脏损伤的机制本次研究成功建立了可卡因所致的小鼠肝脏损伤模型。表现在体重的明显下降和血清中GPT,GOT和LDH活性的急剧升高,肝脏出现明显的病理变化。提示可卡因可以引起急性的严重的肝脏损伤。本次实验还观察到,可卡因能够对小鼠肝脏造成氧化损伤。表现在小鼠肝脏MDA含量的升高和GSH/GSSG的显著降低(P<0.01)。MDA是脂质过氧化的最终产物,其含量的高低可反应膜脂质过氧化程度的强弱和细胞损伤的程度。谷胱甘肽是组织中重要的非蛋白质巯基化合物,有还原态GSH和氧化态GSSG两种形式。GSH是体内强有力的自由基清除剂,可清除组织中过多的H2O2,ROOH等。在机体受到外源化合物的攻击时,GSH能够和外源物质发生反应,保持细胞和细胞器膜结构的完整性,在肝脏的解毒方面起着非常重要的作用。GSH/GSSG的显著降低反映出GSH的耗竭和不足,结果使细胞对毒物更敏感。通过这次实验,可以证实酮康唑对可卡因所致的肝脏损伤具有保护作用。无论是预防性还是治疗性给药,与可卡因组比较,体重和肝重均有升高,血清酶和肝脏的病理表现也更接近正常水平。而单独给予酮康唑亦未显示肝脏损伤。而且从肝脏GSH/GSSG比值和MDA含量的变化中,可以看到酮康唑能够对抗可卡因所致的氧化损伤。目前,对于酮康唑的保护机制和其抗氧化损伤的环节尚不是很清楚,可能与以下因素有关:①作为细胞色素酶P450强有力的抑制剂,酮康唑能够阻止过氧化植烷酸α-氧化为降植烷酸,而后者在参与了细胞色素P450单氧酶系统的氧化过程。而这个系统在可卡因致肝损伤的机制中起了重要的作用。②作为一种抗炎性物质,酮康唑能够促进前列腺素E2的合成,而减少血栓烷A2的生成,后者可以造成肝脏的炎性损伤。③酮康唑能够抑制以大鼠肝微粒体或牛脑磷脂为底物的Fe3+-抗坏血酸依赖的脂质过氧化过程。而且它能够抑制Fe3+-ADP/NADPH系统诱导的微粒体过氧化作用。④酮康唑能够影响鼠巨噬细胞J774系NO合酶的基因表达。而iNOS的减少将最终抑制自由基NO的释放,进而阻止NO介导的可卡因所致的成年雄性小鼠的肝脏损伤。2.3gsh/gssg比值对mda含量的影响从表2结果可见,与溶剂对照比较,可卡因可以使肝脏中GSH/GSSG比值降低,MDA含量升高。而预防性给予酮康唑组,与可卡因组相比,GSH/GSSG比值升高,MDA含量降低。2.4肝胰腺组织病理反应肉眼可见可卡因模型组的肝脏呈黄色的颗粒状病变。光镜下可见肝小叶中心出现大小不等的肝细胞变性和坏死区域,肝细胞大小发生变化,有些肝细胞呈水肿和空泡样变性(图2B)。与之相比,酮康唑预防给药组(12.5mg·kg-1)有很明显的改善(图2C)。50mg·kg-1给药组的肝脏的病理表现基本接近溶剂对照组的正常病理表现(图2D和图2A)。酮康唑单独给药组(200mg·kg-1)肝脏病理改变亦接近正常(图2F)。2.5不同给药剂量对肝重和卡因的影响表3结果显示,与溶剂对照组相比,其余各实验组动物的体重和肝重都有所下降,其中,可卡因组的变化具有显著性差异。与单纯给予可卡因的阳性组比较,给予酮康唑的治疗组的体重有所升高,但是未发现显著性变化。与可卡因组比较,200mg·kg-1给药组肝重的升高具有显著性。肝体比各组之间未见显著性差异。2.6以一种治疗为基础的酮康唑酮活性物质、got和ldh的影响可卡因组