菠菜叶mdna提取及rapd分析

菠菜叶mdna提取及rapd分析

菠菜是属于波斯的一个科。它是一种一级植物，来自波斯。最初，摩尔人引进西班牙，然后在欧洲广泛传播，并于公元647年在中国引入。菠菜依据叶型和种子是否有刺可分为有刺种(又称尖叶种)和无刺种(又称圆叶种)两大类;依据季节可分为春菠菜、夏菠菜、秋菠菜和越冬菠菜。研究取得品种为越冬菠菜,取材后存于硅胶中保存。菠菜营养成分极其丰富,富含维生素A、维生素C及矿物质,尤其维生系A、维生素C含量是所有蔬菜类之冠,人体造血物质铁的含量也比其它蔬菜为多,对于胃肠障碍、便秘、痛风、皮肤病、各种神经疾病、贫血确有特殊食疗效果。对解酒毒及防止齿槽脓漏现象亦具有食疗神效。常食菠菜,具有通便清热、理气补血、防病抗衰等功效,它对各种贫血症和糖尿病、肺结核、高血压、风火赤眼等诸多疾病可起辅助治疗作用。由此,随着人们生活质量的提高,对优良品种的菠菜需求量日益增大。分子标记,其以个体间遗传物质的核苷酸序列变化为基础的理想的遗传标记,是DNA水平遗传多态性的直接的反映,基于DNA扩增(PCR)的标记,目前存在RAPD、AFLP、SSR和ISSR等,其中以RAPD是目前应用最为广泛的分子标记技术。RAPD(RandomAmplifiedPolymorphficDNA)随机扩增多态性DNA,作为一种以Williams和Welsh等提出的以PCR技术为基础的遗传标记技术,它以随机引物(一般为8~10bp),在DNA聚合酶的作用下,通过PCR反应程序非定点扩增DNA片段,然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。进而反映了基因组相应区域的DNA多态性。因此,RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测,也可用于构建基因组指纹图谱;并且,此技术准确性较高,具有不受样本器官发育时期特异性等突出优点,是非常有潜力的一种分析方法。本次实验目的在于以菠菜叶为材料,采用差速离心法进行线粒体的分离,以SDS法提取mtDNA,以期得到高质量的mtDNA来达到RAPD反应体系的需要,本研究选取30个引物进行随机引物多态性扩增,对提取的mtDNA进行了RAPD分析,得出数据。初步建立菠菜叶片mtDNA的多态性图谱,为进一步的菠菜雄性不育系与菠菜mtDNA的关系相关研究提供可行、可靠的依据。1材料和方法供试材料取自沈阳师范大学农菜示范基地,即圆叶菠菜、尖叶菠菜和荷兰菠菜。1.2普析通用仪器有限责任公司、高速冷冻离心所设PCR仪:MG96G,杭州朗基科学仪器有限公司、紫外分光光度计:T6新世纪,北京普析通用仪器有限责任公司、高速冷冻离心机:GL-20G-II,上海安亭科学仪器厂、显微成像系统、超净工作台、电泳仪、电子天平、高压灭菌锅、低温冰箱、烘干箱、微量移液枪、酒精灯、离心管、吸管、量筒、三角瓶、细绳、牛皮纸、烧杯、液氮、硅胶、冰壶。1.3试验药物(1)s-hcl-纯化试剂β-疏基乙醇:Amresco-0482、琼脂糖、FDA、溴化乙锭(EB)、TAE缓冲液、DNAMark-er。SDS提取液:25mmol/LTris-HCl,20mmol/LEDTA,0.5%SDS,pH8.0。纯化试剂:氯仿、异戊醇、异丙醇。随机引物(上海生工生物工程股份有限公司)dNTPs(上海生工生物工程股份有限公司)缓冲液A:50mmol/LTris-HCl,1.3mol/LNaCl,25mmol/LEDTA,0.2%BSA,0.05%半光氨酸,0.5%β-疏基乙醇,pH8.0。缓冲液B:400mmol/L蔗糖,50mmol/LTris-HCl,0.1%BSA,pH8.0。1.4测试方法1.4.1制备增菌剂及色谱梯度(1)取新鲜的菠菜幼叶1~3g,蒸馏水洗涤2~3次,放入陶瓷研钵中,加入适量的液氮,快速研磨破碎组织。过滤回收。(2)将滤液分装于10mL无菌离心管中,1000g,离心10min。(3)将上清液转入新的无菌离心管中,离心15min,离心力分为2000g、2600g、3000g3个梯度,每个梯度2管。(4)将上清液转入新的无菌离心管中,离心15min,离心力分为18000g和20000g2个梯度,每个梯度3管(见表1)。(5)弃上清液,回收粗线粒体。1.4.2检测分离层的制备(1)向线粒体沉淀中加入3~5mL的预冷缓冲液A,摇匀、悬浮沉淀,18000g离心15min,弃上清液,回收线粒体。(2)向沉淀中加5U/μL的DNaseI1μL,10×buffer2μL,三蒸水97μL,充分混匀,37℃温育1h。(3)加1mL0.5mol/LEDTA,pH8.0,混匀静置10min,终止反应。(4)加入2mL缓冲液B,18000g离心15min,弃上清液,回收无污染的线粒体［4－6］。1.4.3提取mtda的方法1.4.3.ctab法常用DNA提取方法为CTAB法和SDS法。对于次级代谢产物和多糖物质多的植物通常采用CTAB法,因其对于这些杂质的去污效果要好;但CTAB法耗时过长,操作复杂。在本实验已经获得较纯线粒体的前提下,且根据线粒体的物质组成主要为水、蛋白质、脂质及核酸,因而选择相对用时短,操作简便的SDS法来提取菠菜mtDNA。1.4.3.rnasea,3234和324.3(1)向沉淀中加入1mL预热的提取液,加入0.5%β-疏基乙醇,65℃水浴1h,每间隔5min摇动一次。(2)加入等体积氯仿:异戊醇(24∶1)混匀,12000r/min离心5min,用宽枪头取上清液。(3)加入两倍体积的-20℃预冷的无水乙醇,-20℃静置2h,12000r/min离心5min,弃上清液。(4)用适量的70%乙醇洗涤沉淀,4℃12000r/min离心5min,弃上清,重复此步骤。(5)将沉淀充分干燥后,溶于适量的(30μL左右)TE,加入1%体积的10mg/mL的RNaseA,37℃静置1h。-20℃保存,备用。1.4.3.物镜下观察取2μL所提取的线粒体,以缓冲液B稀释20倍后,取少量于100倍物镜下观察。取少许稀释液加入荧光素染色,于倒置荧光显微镜下观察检测线粒体活性。1.4.3.测定及纯度分析取1μLmtDNA样品,加三重蒸馏水稀释至99μL,用紫外分光光度计测定A260/A280数值及mtD-NA浓度,并进行纯度分析。取5μLmtDNA样品,0.8%琼脂糖凝胶电泳40min(电压100V),检测mtDNA完整性［7－9］。1.4.3.pcr扩增程序RAPD反应体系为0.1mol/LdNTP、2mol/LMgCl2、0.4μmol/L引物、1.5UTaq酶、25ngmtD-NA,总体系为25μL/管。PCR扩增程序为95℃3min1个循环;94℃1min、37℃1min、72℃2min45个循环;72℃5min1个循环;保存温度4℃。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶在1×TAE电泳缓冲液中,10V下电泳40min［10，11］。2结果分析2.1fpsg的生成荧光素FDA(二乙酸荧光素)是一种荧光染色剂,它本身没有荧光。在进入膜结构之后经非特异性脂酶催化,FDA生成荧光素,荧光素经480nm激光激发发出黄绿色荧光。荧光素可被有活性的线粒体滞留,线粒体死亡或膜结构受损荧光素很快扩散出线粒体,则不能观察到带有绿色荧光的线粒体。在试验中,于100倍镜下可观察到椭圆形线粒体。线粒体在荧光显微镜下呈黄绿色,约有89%的线粒体完整,且具有活性(图1)。2.2rapd分析法检测最佳dna的质量及产量通过紫外分光光度计测定样品,结果表明:差速离心法提取的mtDNAA260/A280,均介于1.757~2.697之间,样品污染程度较低,所得高质量的mtDNA能够满足RAPD分析的要求;此方法平均每克菠菜叶片可以提取mtDNA19.8~23.5μg,mtDNA提取量取决于菠菜叶片的老嫩程度,叶片新嫩容易破碎,其嫩叶的DNA质量和产量都较高,尤其污染相对较低。通过琼脂糖凝胶电泳检测mtDNA完整性。得到的样品带型清晰,无拖尾现象(图2)2.3rapd分析确定三种筛选引物及其范围本次实验提取圆叶菠菜、尖叶菠菜和荷兰菠菜(编号分别为:1、2、3)的mtDNA为材料进行随机引物的筛选,对30条随机引物进行初筛,扩增反应重复两次,选择多态性好且扩增重复性高的随机引物为宜,筛选出4条随机引物,即S7、S16、S21、S24,随后对三种供试材料进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测后,记录数据,进行RAPD分析(图3)。其中,引物S7:1号、2号材料没有条带产生,3号材料有条带产生,可视为3号材料的特异性条带;引物S16:1号材料没有条带产生,2号材料和3号材料条带位置相同,仅可以区分1号材料;引物S21:3种材料均有条带产生,2号材料和3号材料的条带位置相同,仅可以区分1号材料。以上3种引物无法区分3种供试材料,只有引物S24,1号材料和2号材料有条带产生,且位置不同,3号材料没有条带产生,能够特异性的对三种菠菜种类进行种类鉴定。