酮康唑对大鼠肝微粒体细胞色素p450同工酶a31活性的影响

酮康唑对大鼠肝微粒体细胞色素p450同工酶a31活性的影响

细胞色素p450（cyp450）是含有feli函数的酶蛋白，也被称为混合功能氧化酶或单加氧酶。这是肝脏中药物代谢i的主要酶。cyp4503a4（cyp3a4）是一个重要的药物代谢酶。大约38个类别中有150多种药物代谢，约占所有药物的50%。对于各种肿瘤药物的代谢，如环磷酰胺、紫杉醇、长春新碱和基于苦挑选的磺酸盐，这些药物通过cyp3a4代谢，大鼠中相应的亚型为cyp3a。睾酮是CYP3A4体外活性研究的首选探针底物,同时,酮康唑是作为CYP3A4体外抑制剂的专属工具药,是检测药物抑制作用的阳性对照。本实验在前人研究的基础上,在体外孵育体系中运用HPLC法以睾酮作为大鼠CYP3A1的探针底物,定量检测CYP3A1的特异性代谢底物6-β-羟基睾酮,观察酮康唑对大鼠肝微粒体CYP3A1活性的影响,建立一种用大鼠肝微粒体快速考察药物体外CYP3A1抑制作用的方法。1材料和机器1.1dpe现实dpeWaters高效液相系统:Waters717plusAutosample,Waters2487DualλAbsorbanceDetector,Waters1525BinaryHPLCPump。1.2大松、酮康唑二核苷酸磷酸酯类睾酮(testosterone,TS,TRC公司,纯度≥98%);6-β-羟基睾酮(6-β-OHT,TRC公司,纯度≥98%);氢化可的松(hydrocortisone,Hy,Sigma公司,纯度≥99%);酮康唑(ketoconazole,Sigma公司,纯度≥99%);烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH,Sigma,美国);甲醇、乙酸乙酯、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、二氯化镁等其他试剂均为国产分析纯。SD大鼠6只,雄性,SPF级,体重(215±10)g,雄性,中山大学实验动物中心,动物合格证为0092212。2方法和结果2.1药房与动态研究2.1.1柱温度和流动相色谱柱:大连依力特HypersilBDSC18柱(4.6mm×150mm,5μm);柱温:室温;流动相:甲醇-10mmol/LNa2HPO4水溶液(pH8.25)(体积比50∶50);检测波长:254nm;流速:1ml/min;进样量20μl,内标为氢化可的松。2.1.2标准储备液及实验用松溶液的配制精密称取0.288g睾酮至5ml容量瓶中,加甲醇溶解稀释至刻度,摇匀,得到0.2mol/L的TS母液。置冰箱4℃备用。精密称取1mg6-β-羟基睾酮至5ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,得200mg/L的标准储备液,置冰箱4℃中备用。精密称取氢化可的松25mg至5ml容量瓶中,用甲醇:水(1∶1)溶解稀释到刻度,摇匀,即得到5g/L的储备液,置冰箱4℃备用。精密称取酮康唑2.5mg至5ml量瓶中,用甲醇:水(1∶1)溶解稀释到刻度,摇匀,即得到500mg/L的储备液,置冰箱4℃备用。2.1.3肝组织匀浆的制备大鼠禁食12h,自由饮水,各大鼠称重后,将动物断头处死,剖腹,取出肝脏;用4℃生理盐水冲洗2～3次,直至洗出液为无色或淡黄色;吸干组织并称重,取5g左右肝组织;在0.25mol/L蔗糖溶液中制成20%W/V的匀浆,组织匀浆液在10000g离心20min,保留上清液,弃去下层沉淀物;取上清液转移至超速离心管,在105000g离心60min,弃去上清液,沉淀用0.1mol/LTris-HCL缓冲液重悬;再105000g离心60min,沉淀用10mlTris-HCL缓冲液混悬均匀,分装,于-80℃保存备用。2.1.4标准曲线的绘制取标准蛋白(5mg/ml)10μl,用PBS溶液稀释至0.5mg/ml。将标准品按0,1,4,8,12,16,20μl加到96孔板中,用磷酸缓冲液(pH7.4)(PBS)稀释至20μl,配置BCA工作液,在样品孔中加入配置好的BCA工作液200μl,于37℃恒温箱中静置30min,于562nm测定吸收度,以蛋白浓度与吸光度绘制标准曲线,测得大鼠肝微粒体浓度。2.1.5氢化钠系投资主体3.4的水浴加热反应精密吸取0.02mol/L的睾酮溶液5μl于10ml玻璃离心管中,加入适量制备好的空白肝微粒体,使药物反应体系中肝微粒体蛋白终浓度为0.25mg/ml,用磷酸缓冲液(pH7.4)补足体系至480μl。于37℃水浴中预孵育5min后,加入20μlNADPH(0.01mol/L)启动反应,37℃水浴20min后,加入10μl内标氢化可的松(50mg/L),加入3.5ml冰冷乙酸乙酯终止反应。取终止代谢的样品,涡旋1min,室温放置10min,3500r/min离心10min,吸取上清液转移至另一离心管中,于真空干燥箱中挥干后用甲醇:水(1∶1)400μl溶样。涡旋1min,13000r/min离心15min。吸取上清250μl进样。2.1.6峰分离稳定性分析上述试验条件下,测得6β-OHT,内标氢化可的松,TS与其他杂质组分峰分离良好,保留时间分别约为5.740,8.303,26.962min。3种物质与TS的其他代谢产物分离良好,且空白肝微粒体中的内源性物质不干扰测定。2.1.7样品处理和线性范围取10ml具塞离心管,分别加入0.3125,0.625,1.25,2.5,5,10,20mg/L的6β-OHT溶液50μl,于各管中加入5μl0.2mol/L的TS溶液,以及灭活大鼠肝微粒体(终浓度0.25mg/ml),用PBS补足体系至500μl,按照上述样品处理的方法操作,以6β-OHT与内标氢化可的松的面积比为横坐标,其各自对应的6β-OHT的浓度为纵坐标进行线性回归,得标准曲线,其回归方程为Y=19.175X-1.277(R2=0.9997),6β-OHT的线性范围为0.3125～20mg/L,最低定量限为0.3125mg/L,这一范围内线性关系良好。2.1.8方法的精密度、准确度、重复性取大鼠灭活肝微粒体(终浓度0.25mg/ml),加入5μl0.2mol/L的TS溶液,分别加入0.625,2.5,10μg/ml6β-OHT溶液50μl,用PBS补充体系至500μl,按照上述样品处理的方法操作,进样测定,于当天不同时间内测定峰面积各5次,连续3d,计算日内、日间精密度,结果见表1。2.1.9样品处理和进样测定取大鼠灭活肝微粒体(终浓度0.25mg/ml),加入5μl0.2mol/L的TS溶液,分别加入0.625,2.5,10mg/L6β-OHT溶液50μl,用PBS补充体系至500μl,按照上述样品处理的方法操作,进样测定。每个浓度水平测定5次,测定峰面积比,以标准曲线计算6β-OHT检测量,以检测量与加入量之比计算6β-OHT的方法回收率。取灭活肝微粒体(终浓度0.25mg/ml),加入5μl0.2mol/l的TS溶液,分别加入0.625,2.5,10μg/ml6β-OHT溶液50μl,用磷酸缓冲液(pH7.4)补充体系至500μl,按照上述样品处理操作,进样测定。每个浓度水平测定5次;另取上述3个浓度的6β-OHT溶液50μl,加甲醇:水(1∶1)至400μl,涡旋1min,13000r/min离心15min,吸取上清250μl,进样测定。每个浓度测定5次,将2组峰面积/内标峰面积比值之比进行比较,计算6β-OHT的萃取回收率,结果见表1。2.2cyp31a活动的实验设计2.2.1体外添加nadph法分成对照组及药物处理组共7组,每组3个样本。首先把肝微粒体加入到21个离心管中(终浓度为0.25mg/ml);然后各处理组分别加入5、10、20、50、100、200mg/L的酮康唑各25μl,再加入含有PBS培养液;对照组只加入上述培养液;混匀后放入37℃培养箱中孵育15min,然后在7个组加入0.2mol/L的睾酮5μl、0.01mol/LNADPH20μl和0.25mmol/L二氯化镁10μl,使孵育体系体积为500μl,继续孵育20min,最后加入内标物氢化可的松10μl,并用乙酸乙酯3.5ml终止反应。取终止代谢的样品涡旋1min后室温放置10min,3500r/min高速冷冻离心机离心10min,吸取上清液转移到另一离心管,然后在真空干燥箱中吹干,用甲醇:水(50∶50)400μl溶解,涡旋1min后再转移到另外的离心管中用13000r/min离心15min,吸取上清液250μl用高效液相色谱仪测定睾酮经3A1代谢所生成6-β羟基睾酮的量,用HPLC法测定的AUC表示酶的活性,以对照组酶活性为100%,计算CYP酶的同工酶3A1酶相对活性。2.2.2统计处理用SPSS10.0统计学软件处理。数据用(x¯±s)(x¯±s)表示,组间比较采用t检验,组间率比较用χ2检验。3cyp450的药物安全性评价本实验观察酮康唑对大鼠肝微粒体CYP450代谢睾酮的影响,结果表明,随着酮康唑浓度的不断升高,CYP3A1活性随之逐渐下降,表明酮康唑对CYP3A1活性有显著的抑制作用,有统计学意义(P<0.05),与之前文献报导相符。应用HPLC测定CYPP450活性对新药临床药物安全性评价和药物相互作用研究具有重大意义。药物对CYP450的诱导或抑制是临床发生药物间相互作用的一种重要原因和方式,一般来说,酶抑制作用的临床意义大于酶促作用,约占全部相互作用的70%,了解药物对CYP450抑制作用,有助于评价药物安全性,指导临床合理联合用药,同时应注意避免药物相互作用的发生,减少药物不良反应。本实验在前人研究的基础上