菜蛾变形孢虫孢子分离纯化方法的研究

菜蛾变形孢虫孢子分离纯化方法的研究

变形头虫是吉林省农业科学院植物系研究人员从晓草科中分离出的一种微生态学昆虫。研究证明,该种孢虫对小菜蛾有较强的致病性和传播性。为了进一步进行菜蛾变形孢虫的生理生化及分子生物学研究,需要找出纯化孢子的有效方法。本文参照文献报道的本属其它种类及不同属微孢子虫纯化方法,采用差速离心和密度梯度离心方法对小菜蛾变形孢虫孢子进行了分离纯化研究,以确定纯化该种孢虫的最佳方法。1材料和方法1.1大量繁殖繁殖微孢子虫:菜蛾变形孢虫,由吉林农业大学植保系从小菜体内分离出,用亚洲玉米螟进行大量繁殖。试剂:Percoll,瑞典Pharmacia公司产品主要仪器设备:北京医疗仪器修理厂生产的LXJ-64-01离心机德国eppendorf出品的Minispin台式离心机SORVALLRC5Cplus高速离心机1.2实验方法1.2.1饲养、饲养用少量浓缩孢子液涂抹亚洲玉米螟黑头卵,幼虫孵化后接入人工饲料,在25±1℃L:D=16:8条件下饲养20-22天,至幼虫老熟,收获孢子。1.2.2除杂剂、过滤滤液、rpm液将病虫去除表皮及中肠内容物,放入组织研磨器中研磨匀浆,匀浆液用160目铜网过滤,滤液用3000rpm离心15min,去其上清液,剔除杂质。将沉淀重新悬于蒸馏水中,离心洗涤数次,至上清液基本澄清,得到孢子粗提液。1.2.3纯度sid测试将孢子液稀释后用血球计数板分别数孢子数及杂质数,或直接计数5个视野的孢子数和杂质数,求出孢子纯净度。1.2.4微丝虫纯度1.2.4.percoll水溶液根据文献报道及Percoll的性质设如下处理:(1)50%Percoll水溶液(v/v,下同)+孢子悬液充分混匀,3000rpm,离心20min。(2)50%Percoll0.15MNaCl溶液+孢子悬液充分混匀,3000rpm,离心20min。(3)50%Percoll0.25M蔗糖溶液+孢子悬液充分混匀,3000rpm,离心20min。(4)30%Percoll水溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,10,000g,离心20min。(5)50%Percoll水溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,10,000g,离心20min。(6)70%Percoll水溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,10,000g,离心20min。(7)30%PercollNaCl溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,10,000g,离心20min。(8)50%PercollNaCl溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,10,000g,离心20min。(9)70%PercollNaCl溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,10,000g,离心20min。(10)30%Percoll蔗糖溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,25,000g,离心20min。(11)50%Percoll蔗糖溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,25,000g,离心20min。(12)70%Percoll蔗糖溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,25,000g,离心20min。(13)70%PercollNaCl溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,8,000g,离心20min。(14)70%Percoll水溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,8,000g,离心20min。(15)30%,50%,75%Percoll水溶液非连续密度梯度离心,4℃,10,000g,离心20min。(16)30%,50%,75%PercollNaCl溶液非连续密度梯度离心,4℃,10,000g,离心20min。(17)50%PercollNaCl溶液,在液面上轻加入1-2ml孢子悬浮液,4℃,10,000g,离心25min,与孢子悬液同Percoll充分混匀的做比较。1.2.4.非连续密度梯度用30%、40%、50%、60%蔗糖溶液(W/W)制成非连续密度梯度液,将孢子悬浮液1ml左右轻铺于梯度液顶层,4000rpm离心1.5h。1.2.4.离心液铺设工艺Percoll及蔗糖均按正梯度铺置密度梯度,即最高浓度液置最下层,向上浓度依次降低。铺制方法为:先将最低浓度的离心液置于离心管内,将一根细长的滴管轻轻插入到离心管底,用注射针依次慢慢推入较高浓度的离心液。最后推入的离心液浓度最高,轻轻抽出长滴管,若各不同浓度溶液间分层清晰,溶液即铺设成功。加样:用注射针加样,针头和离心管成45-60°角,慢慢将样品沿管壁铺到梯度离心液液面上。1.2.4.4.4离心后样品的回收进行密度梯度离心后,将出现多条带,用长颈细吸管分别仔细吸取各层的分离物,用蒸馏水离心洗涤,去掉离心介质,镜检各层分离物。2结果与讨论2.1试验结果2.1.1percollanacl和蔗糖溶液离心后组织片的形态检测Percoll离心后可自发形成密度梯度,高速离心时,将样品与介质预先混合,然后在原位产生梯度进行离心。用这种方法,梯度形成和样品分离只需一次完成。本试验中用30-70%Percoll溶液对样品进行分离,实际上属于连续密度梯度离心。30-70%Percoll水溶液、NaCl溶液、蔗糖溶液在离心后,除个别处理外大部分处理样品在离心后分两部分:漂浮在离心介质液面的顶层及沉淀。分布状况见表1。经镜检确认,顶层均为组织碎片,但组织碎片在不同的离心介质中分布疏密程度不同,因而顶层的厚度仅能部分代表分离出的杂质的多少。30%PercollNaCl溶液与30%Percoll蔗糖溶液离心后未出现顶层,说明这两个处理不具有进一步纯化孢子的作用。上清液经镜检发现不含孢子和杂质。肉眼可分辨出沉淀分3层:黑褐色层、灰白色层及雪白色层。黑褐色通常位于沉淀的最底层,量较少;灰白色在沉淀中所占比例最高,分布于中层或上层,因离心介质而异;雪白色通常量最少,分布在中层或上层。经分层镜检得知,沉淀的主要成分为孢子,雪白色沉淀为纯孢子,灰白色沉淀中混有组织碎片,黑褐色沉淀中组织碎片含量最多。不同的处理沉淀的量、颜色、分布略有不同,综合比较分离出的组织碎片的含量和沉淀的分层情况及纯净程度,认为50%及70%的PercollNaCl溶液和蔗糖溶液纯化孢子效果较好,其次为50%及70%的Percoll水溶液。但除雪白色部分外,其余部分仍需进一步纯化。2.1.2组织+前药带过长带和下含从子带+前原管再沉序样品在30%、50%、75%非连续密度梯度PercollNaCl溶液中,经4℃10,000g离心20分钟后,在离心管中形成3个条带及沉淀。第一条带接近液面,第三条带位于管底向上2/5处,第二条带位于一、三条带之间并与一、三条带等距。第二条带最宽,其次为第一条带,第三条带最窄。将各条带分离出并进行镜检,每样品检查5个视野,结果见表2。沉淀分3层上层灰色:组织+孢子,中层纯白:纯孢子,下层灰白:组织+孢子被分离出的组织碎片均较大,大小大约为0.075×0.1mm2左右。条带中所含孢子均为未成熟孢子或空孢子。样品经30%、50%、75%非连续密度梯度Percoll水溶液10,000g离心20min后检查,未看出分层,但把上清液倒出后,上清中慢慢形成稀疏的浮层,应为原管中形成的条带。可能由于离心管为半透明且条带十分弱,导致开始时未发现有条带形成。镜检浮层为大型组织碎片,混有极少量未成熟孢子。沉淀为黑色至灰白色,其中主要为孢子,但仍混杂大量组织碎片,还需进一步纯化。2.1.3梯度液沉淀处理工艺样品经30%、40%、50%、60%非连续密度梯度蔗糖溶液4000rpm离心1.5h后,梯度液部分发生混合,只有50%、60%之间尚可分辨出梯度层。沉淀位于原40%与50%梯度液之间的管壁上。经镜检以组织碎片为主,并含较多孢子,未见专门的孢子沉淀或区带。认为此法不适用孢子纯化。2.1.4纯化的纯度样品经Percoll密度梯度离心后,又分离出大量组织碎片,孢子得到了进一步的纯化,但仍未达到我们所需要的纯度。取上述沉淀进行差速离心,经反复试验,确定用如下程序:取沉淀重新悬浮后在800-1000rpm下离心2min,弃掉沉淀,将其上清液在3000rpm下离心10min,得到的沉淀即为纯净的孢子。3微粒子虫的分离纯化过去,国外普遍采用LUDOX作为微孢子虫分离纯化的密度梯度离心介质,LUDOX是一种以NaOH为溶剂的40%的硅胶悬液,pH9.8,密度为1.10g/mL。由于LUDOX溶液呈碱性,常导致在离心过程中孢子萌发,为克服这一缺点,后将其缓冲为近似中性,但LUDOX是一种地板上光剂主要成分,其商品包装最小为208升,实验室使用不方便。1981年Jouvena首次采用Percoll分离纯化微孢子虫孢子,取得很好的效果。Percoll商品包装规格小,适于试验室使用。而且Percoll由于有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)包裹,具生物学上的惰性,对细胞无毒性,其pH值为9.0,并可以在pH5.5-10.0之间进行调节。目前,国外已普遍使用Percoll做为微孢子虫离心纯化的介质。国内近几年已有报道用Percoll分离纯化家蚕微粒子,不同种微粒子虫由于密度不同,所需Percoll浓度及离心力均不同,本试验结果表明,Percoll也适用于菜蛾变形孢虫的分离纯化,经Percoll密度梯度离心后孢子可满足大多数试验需求。但对孢子纯度要求高的试验,还需与差速离心方法结合,才能达到要求。根据试验结果,我们推荐菜蛾变形孢虫孢子分离纯化的标准程序为:(1)将病虫研磨成匀浆液。(2)