茶碱与牛血红蛋白相互作用的荧光光谱法研究

茶碱与牛血红蛋白相互作用的荧光光谱法研究

蛋白质与内源性化合物和许多药物分子之间的相互作用的研究一直受到关注。血红蛋白(Hb)是一种由4个亚基组成以血红素为辅基的结合蛋白,是动物及人体内执行输氧任务的蛋白质。茶碱为黄嘌呤的N-甲基衍生物,对呼吸道平滑肌具有较强的直接松弛作用,可缓解支气管痉挛,是目前常用的平喘药之一,但因其安全性范围较小,常需进行临床药物监测。目前,对茶碱以及与蛋白质作用的研究,主要是关于茶碱的血药浓度监测以及其衍生物的发光特性、对蛋白质结构影响等方面,而对于血红蛋白与茶碱的作用机理及热力学性质则少有报道。本文通过荧光光谱技术研究了茶碱与牛血红蛋白(BHb)间的相互作用,并利用生物大分子与小分子作用的位点结合模型,对其猝灭常数、结合常数和结合位点数进行了测定。同时考察了茶碱对牛血红蛋白构象的影响。1实验部分1.1实验试剂和仪器带恒温系统的LS-50B型荧光光度计(美国Perkin-Elmer公司);pHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂);ZC-18Q智能型超级恒温水槽(宁波天恒仪器厂);高纯水制备仪(日本Millipore公司)。茶碱(分析纯,上海国药集团化学试剂有限公司)配制成1.188×10-3mol/L的储备液待用;牛血红蛋白(Belgoum,美国)配制成2.65×10-6mol/L储备溶液并于冰箱中(温度低于5℃)保存,以上试剂均用三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲溶液(内含0.15mol/LNaCl维持离子强度)配制。除Tris为生化试剂外,其余试剂均为分析纯,实验用水为高纯水(电阻率为18.2MΩ·cm)。1.2荧光光谱测定移取2.5mL2.65×10-6mol/LBHb于1cm的石英比色皿中,用微量注射器逐次加入1.188×10-3mol/L的茶碱溶液进行荧光滴定(滴定剂累加体积小于0.1mL),每次加入溶液后混合均匀,在一定温度下作用10min后,于280nm激发波长下进行荧光扫描。光源为脉冲式氙灯,发射与激发狭缝宽度均为5nm,扫描速度500nm/min,在LS-50B型荧光分光光度计上记录300～400nm波长范围内的发射光谱;固定Δλ=20或60nm,记录茶碱与BHb作用的同步荧光光谱。2结果与讨论2.1关于光学常数和自杀机制的讨论2.1.1服务意识不强的织物和茶碱蛋白质的内源荧光来自于分子中的色氨酸残基和酪氨酸残基。在280nm光激发下,BHb分子中色氨酸和酪氨酸残基的荧光发射峰位于330～340nm附近。图1为固定BHb浓度下体系的荧光发射光谱随茶碱浓度的变化。可以看出,随着茶碱浓度的增加,发射峰波长保持在337nm左右,但蛋白质的内源荧光强度有规律地降低,说明两者之间存在着相互作用,发生了能量转移。2.1.2荧光或ksv反应前后a荧光物质分子可以与溶剂分子或溶质分子之间发生导致荧光强度下降的物理或化学作用,这一现象被称为荧光猝灭。广义上说,任何可以使荧光强度降低的作用都可以称之为荧光猝灭。荧光猝灭过程通常可以分为动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用引起的,其过程遵循Stern-Volmer方程。F0/F=1+Ksvcq=1+Kqτ0cq(1)式中:F0和F分别表示不加入和加入猝灭剂时体系的相对荧光强度;Ksv为动态猝灭常数(即Stern-Volmer猝灭常数);cq为猝灭剂的浓度;Kq为荧光猝灭速率常数,各类猝灭剂对生物大分子的最大Kq值一般为2.0×1010L·mol-1·s-1;τ0为不存在猝灭剂时荧光物质的平均寿命,生物大分子的荧光平均寿命一般约为10-8s-1。根据图1,假设茶碱对BHb的荧光猝灭过程为动态猝灭,则由式1作出血红蛋白荧光猝灭的Stern-Volmer曲线,如图2所示,由图中直线的斜率及截矩可求出Ksv和Kq,结果见表1。从表1结果看,Kq的数值在1012数量级,远大于2.0×1010L·mol-1·s-1,从这个角度考虑,茶碱对BHb的猝灭机理为静态猝灭。2.2茶碱与brb的相互作用关系茶碱与BHb的静态猝灭结合常数可用Lineweaver-Burk双倒数函数关系式求得,其常数KLB与荧光强度、猝灭剂浓度之间的关系为:1F0−F=1F0+1KLBF0cq(2)作(F0-F)-1～cq-1图以求取KLB等相关数值。当温度变化不大时,结合反应的焓变ΔH可看成一个常数,根据下列热力学公式3～5可以求得结合反应的标准吉布斯自由能变ΔG⦵、焓变ΔH⦵、熵变ΔS⦵(见表2)。ΔG⊖=−RTlnK⊖(3)ΔS⊖=(ΔH⊖−ΔG⊖)/T(4)lnK⊖2K⊖1=ΔH⊖R(1T1−1T2)(5)从表2可以判断,茶碱与BHb的结合是一个自发过程(ΔG⦵<0)。根据药物与蛋白质间的作用力类型,当ΔH>0,ΔS>0时,茶碱与血红蛋白分子间主要为疏水作用力结合,ΔG⦵主要来自熵变的贡献,即熵变效应在药物与血红蛋白相互作用的稳定性中占主导地位。同时可以看出,温度对茶碱与BHb的结合常数KLB影响较小,故可进一步确定茶碱对BHb的猝灭为静态猝灭。2.3茶碱结合brb的结果分析茶碱对BHb的猝灭机理为静态猝灭,则二者的结合符合荧光物质-猝灭剂间的结合表达式:lg[(F0−F)/F]=lgK+nlg[cq](6)由式6作lg[(F0-F)/F]～lgcq图,在T=295.15K时,其线性方程为lg[(F0−F)/F]=4.3048+1.029lgcq(7)线性相关系数r=0.9998。由所得直线的截矩计算得表观结合常数K=2.0174×104L/mol,结合位点数n=1.029。可以看出,茶碱与BHb的作用较强,且每一个茶碱分子与一个蛋白质分子结合形成配合物;同时温度对茶碱与血红蛋白的结合位点数及表观结合常数影响较小,这也更加说明茶碱与血红蛋白的作用过程为静态猝灭。2.4不同浓度茶碱对酪氨酸和色氨酸残基的影响对于蛋白质的同步荧光光谱,△λ=15nm时仅表现为酪氨酸残基的荧光,△λ=60nm时则显示色氨酸残基的荧光。因残基的最大吸收波长与其所处环境的极性有关,故由发射波长的改变可判断蛋白质构象的变化。若最大发射波长红移,表明残基所处环境的极性增加,蓝移则表明疏水性增加。固定血红蛋白浓度,逐渐增大茶碱的浓度,绘制血红蛋白的同步荧光光谱。经实验获得,分别选择波长差△λ=20和60nm考察茶碱对酪氨酸和色氨酸残基的影响(图3a、b)。从图中可以看出,随着茶碱浓度增大,酪氨酸和色