生物制药工艺学课件

生

物

制

药

工

艺

学

生物制药工艺学

主讲教师：吴梧桐教授

《生物制药工艺学》主要参照书

1．吴梧桐主编《生物制药工艺学》第二版，北京，中国医药科技出版社，2023.2．王志军主编《生物技术药物研究开发和质量控制》，北京，科学出版社，2023.3．吴剑波《微生物制药》，北京，化学出版社，2023.杂志期刊：1.中国抗生素杂志.2.药物生物技术.3.中国生物工程学报.4.中国生化药物杂志.5.中国天然药物.6.中国医药工业.生物制药工艺学Biopharmaceuticalprocess

一、学习本课程的目的：1、培养自己掌握扎实的专业知识，具有创新、创业能力的高素质人才，按联合国科教文组织对世界大学生的要求：（1）Learntoknow.(2)Learntodo.(3)Learntobe.(4)Learntotogether.2、培养自己成为药物研究、生产、流通、应用与管理的专门人才。为人民的防病、治病、保健、康复提供疗效好，副作用少，价格便宜，使用以便的生物药物。二、本课程的性质：是生物技术、生物工程、海洋药学、生化制药、微生物制药、、生物技术制药的专业必修课，也是药学专业的主要选修课。三、本课程研究内容是从事各类生物药物的研究，生产和制剂工艺过程的一门综合性应用技术科学。（1）生化与微生物药物制造工艺。（2）生物技术药物与生物制品制造工艺。（3）其他生物医药产品（康复保健品）制造工艺。四、学习任务与要求：（1）掌握制造工艺基本原理及有关基础理论。（2）熟练制造技术过程及制剂技术。（3）熟悉生物药物的起源、构造、性质及临床用途。第一章生物药物概述

IntroductionofBiopharmaceutics

1．药物Medicine(remedy)药物是用于预防、治疗或诊疗疾病与调整机体生理功能、增进康复促健的物质，有4大类：（1）预防药物：如疫苗、卡介苗、艾滋病疫苗、SARS疫苗、肿瘤疫苗。（2）治疗药物：如抗生素、INS、尿激酶。（3）诊疗药物：如肝肾功能检验试剂盒、免疫诊疗试剂盒。（4）康复保健药物：如维生素、氨基酸、叶酸。2．药物Drug直接用于临床的药物制剂产品，是特殊商品。药物特点：有固定构成，明确要求有适应症、使用方法与用量，疗程，并阐明可能存在的毒副反应。还要求使用使用期。药物有3大类：（1）化学药物，（2）生物药物，（3）中药（药材，饮片，中成药）。

生物药物Biopharmaceutics

是以生物材料（生物体、生物组织或其成份：组织、细胞、细胞器、细胞成份、代谢物、排泄物）为原料，综合应用生物学、物理化学与当代药学的原理与措施加工制成的药物。一般有5类：（1）生化药物Biochemicalmedicine（2）微生物药物Microbialmedicine（3）海洋药物Marinemedicine（4）生物制品Biologics(biologicals)（5）生物医药产品Biologicalmedicinalproducts伴随生物技术药物的迅速发展，当代生物药物已形成4大类：（1）重组DNA药物（涉及基因工程和蛋白质工程药物）（2）基因药物geneticmedicine（核实类药物，以遗传物质DNA、RNA为治疗物质基础的药物），如核实疫苗、反义药物。（3）天然生物药物（4）合成或半合成药物。第一节生物药物的研究与发展前景一、生物药物研究发呈现状生物药物的发展已走过老式生物制药技术和工业化生物制药时代，从1982年10月rhIns上市，正式步入当代生物制药阶段。1、世界现状：已上市200多种生物技术药物，已进入Ⅲ其临床400种；其中200种进入FDA审批，还有700多种进入Ⅰ-Ⅱ期临床，在各个不同临床前研究的有2600多种。二、生物药物的发展与展望1．生物技术药物研究已进入蛋白质工程药物时代第一代重组药物时代：一级构造与功能和天然活性蛋白质完全一样；第二代重组药物时代：对天然产物体现物进行简朴修饰，如PEG化或糖基化；第三代重组药物时代：蛋白质工程药物，在DNA水平上，合理设计、改造、创制新型治疗蛋白。目的：（1）提升活性；（2）降低或消除毒副作用；（3）提升体内外稳定性；（4）产生新的功能特征。如：迅速Ins，B9-Ser→B9-Asp,B27-Thr→B27-Glu长久有效Ins,B21-Asn→B21-Gly,B-C末端加入2个ArgPI由pH5.4→pH6.82.中国现状：（1）生产生化药物100多种，抗生素近100种；（2）已同意生物技术药物30多种：如INF-α1b,INF-α2a,INFα2b,INF-γ,IL-2,IL2-ser125,IL-11,G25F,GM-CSF,γ-SK，γGH，EPO，TPO，EGF，EGF衍生物，bFGF，Ins，TNF衍生物，脑钠素，心钠素，抗IL-8单抗乳膏剂，胸苷激酶基因工程细胞制剂，CHO乙肝疫苗，痢疾疫苗，WuT3单抗（抗CD3CMAb，抗肾移植排斥），131I-chTNT人鼠嵌合型单抗（治肺癌），P53腺病毒抗癌注射剂，葡激酶等，已进入临床的有SARS疫苗，禽流感疫苗，艾滋病疫苗。中国生物制药企业近代生物制药企业经过GMP的厂家已近200家，年产值400多亿元，仅占全国医药产值7.5%发展空间可观（美国400多亿美元/年），已开始进入自主创新阶段。如：（1）γ-bFGF(全球首家上市)；（2）思凯通（注射SK，1997年上市）；（3）注射用重组葡激酶（2023年上市）；（4）今又生Gendicine（P53腺病毒注射剂）；（5）TNF衍生物2.哺乳动物细胞体现产物所占比重迅速增长2023年已同意创新生物技术药物：酵母体现产品2种，E.coli体现产品4种，分子量均在3.5KDa~6KDa,表达它体现多肽有优势，而经过动物细胞体现系统22种（涉及抗体、酶、凝血因子）如：TNKase(t-pA突变体)；（58KDa）；AlsuraZyme（laromidase）(58KDa治疗粘多糖病)Fabrazyme（Algasidasebeta,100KDa,治疗Fabry’s病）3.治疗性抗体发展迅猛FDA已同意17种治疗性抗体，在抗肿瘤、治疗风湿性关节炎，预防感染、抗血小板凝集等方面疗效突出。在369种进入临床试验的生物技术药物中有75种是抗体类产品，估计2023年会有17种上市。如抗TNFα嵌合抗体，TNFα-R-Fc融合蛋白。抗体人源化分为（1）嵌合抗体：用人源抗体恒定区替代鼠源抗体恒定区，保存抗体可变区。(2)人源化抗体:可变区中仅CDR（轻链可变区）为鼠源，其FR及恒定区均来自人源。4、干涉RNA（RNAi）RNAinterference，是细胞内外源性或内源性双链RNA，可引起与其同源的mRNA特异性降低，克制基因体现，是抗病毒、抗肿瘤治疗剂的主要设计方向。5、基因治疗剂：DNA疫苗与基因药物发展迅速，将功能基因与体现载体重组，导入人体细胞，使其在体内体现活性蛋白，产生免疫或治疗作用。已研究成功乳腺癌DNA疫苗（可能对病毒性肿瘤均可取得成功），还有黑色瘤基因治疗也取得突破（使病人晚期肿瘤消失），将病人的T-cell分离出来，用肿瘤抗原受体基因改造T-cell，再注入人体，能够对黑色素瘤产生有效清除作用。

第二节

生物药物的性质与类别一、生物药物的特征（CharacterizationofBiopharmaceutics）（一）生物学特征：1、构成、构造与天然活性物质一致，是生物进化与自然选择的成果。2、具有调整、控制生物功能，战胜疾病的物质基础。3、对人体进行补充、调整、增强、克制，替代或纠正代谢失调更为合理和有效。4、活性强，毒副作用一般较少，针对性强，疗效确切，还有营养作用。5、是创新药物的优良先导物，经过分子设计能够研制新型有效药物，如从抑长素研制环己肽（环6肽）。28肽———环6肽Pro-Phe-D-TrpPe-Thr-Lys(二)、化学特征：（1）含量低、杂质多、工艺复杂、收率低、技术要求高；（2）构成构造复杂，具严格空间构造，才有生物活性。对多种物理、化学、生物学原因不稳定，故研究时要执行GLP规范，生产时要求GMP管理。（3）活性高，有效剂量小，对制品的有效性，安全性要严格要求（涉及原则品的制定）。二、生物药物的类别：共分4大类（一）天然生物药物1．微生物药物microbilmedicine由微生物产生的生理活性物质：涉及初级及次级代谢产物和转化产物。（1）抗生素：抗菌、抗肿瘤抗生素，如青霉素，链霉素，红霉素，四环素，多粘菌素，两性霉素B，氯霉素，利福霉素，磷霉素等。（2）酶克制剂：如克拉维酸，β-内酰胺酶克制剂(青霉素增效剂)（3）免疫克制剂:如环孢霉素A2．生化药物（含海洋药物）：Biochemicalmedicine用生物化学的原理与技术从动植物、海洋生物和微生物制取的生化活性物质。（1）氨基酸类药物aminoAcid如胱AA、色氨酸、精氨酸等。（2）多肽类药物Polypeptide如缩宫素、加压素等。（3）蛋白质类药物如人血白蛋白，r-球蛋白（4）酶类药物如胃蛋白酶，尿激酶（5）辅酶类药物如CoQ10,CoASH（6）核苷酸与核酸类药物如RNA注射液：PolyI:C（7）多糖类药物（polysaccharide）:如肝素、玻璃酸。（8）脂类药物：如去氢胆酸，胆红素、PGE1、PGE2。

（二）生物技术药物（新生物制品）Biotech-drugs1.DNA重组药物（DNArecombinantmedicine）－基因工程与蛋白质工程药物（1）细胞因子干扰素类药物:IFNα,IFN-β,IFNγ（2）细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子:IL-2,IL-6,IL-11;TNF-,TNF-R（3）造血系统生长因子类：G-CSF,GM-CSF,EPO,TPO,SCF（4）重组蛋白和多肽类激素药物：Ins，rHGH,FSH,LH,HCG（5）生长因子类药物:EGF，PDGE，TGFα，NGF（6）心血管病治疗剂与酶制剂:水蛭素，t-PA，尿激酶，门冬酰胺酶（7）重组蛋白疫苗与基因工程治疗性抗体：乙肝疫苗、丙肝疫苗、对淋巴瘤CD3单抗（OKT3）抗排斥。HER-2（表皮生长因子受体抗体），抗乳腺癌转移（人源化抗体）2.基因药物（核酸类药物）(1)核酸疫苗：将目的基因与体现载体构建成重组体导入人体，使其体现免疫蛋白，呈递免疫应答，如乳腺癌疫苗。(2)反义药物ISIS2900，用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎。（三）合成或半合成生物药物：如催产素，降钙素，PEG-腺苷脱氨酶，PEG-门冬酰胺酶第二章生物制药工艺技术基础

Basisofbiopharmaceuticaltechnology

第一节微生物制药工艺技术基础

一、菌种的选育与保芷1．自然选育是一种纯种选育措施，根据自发突变原理，经过不断分离筛选，除去衰变型菌落，选择高产菌，达成强化、复壮、稳定生产目的。操作：单孢子悬浮液→分离及单菌落培养→筛选纯培养：从一种单细胞微生物取得的后裔培养称纯培养措施：（1）平板划线法（2）稀释平板法2．诱变育种

（1）诱变处理：①化学诱变；②物理诱变

（2）代谢调整选育

（3）基因重组技术变化代谢途径

（4）原生质体融合

突变株筛选一般进程如图所示

第三第四轮同第二轮3．菌种保存

（1）保存目的：预防退化（2）菌种退化检验措施（3）菌种退化预防措施（4）菌种保芷措施：①斜面低温保存4℃，湿度<70%，细菌可保存1月，放线菌2月，酵母4～6月；②液体石蜡封芷法121℃×30mm灭菌，干燥，封管；③甘油冷冻法；④冷冻干燥法；⑤液氮保藏法二、发酵工程技术基础

发酵工程：单细胞纯培养工业化过程，以产生大量目的物。

1．液体培养——深层发酵

2．固体培养——浅盘培养

发酵设备：空压机、种子罐、发酵罐，蒸汽发生器、空气过滤器、离心机及多种参数控制与检测设备，以L-Lys生产设备为例，见图1所示。

图1L-Lys生产过程工艺设备图

第二节生物药物提取、分布、纯化技术基础一、生物材料的选择：1．生物活性物质存在部位：胞内、胞外、胞浆、质膜、器膜、周质2．生物材料的采集与质控（1）品种鉴定；（2）预防污染与感染；（3）选择富集目的物材料；（4）冷冻保存

二、生物活性物质的提取，浓缩与干燥

1．提取措施与优化

（1）溶剂选择

（2）添加剂①保护剂；②酶克制剂

（3）提取条件①温度；②pH；③盐；④表面活性剂

HLB值可供选择表面活性剂

（一般10～20为佳）

优化：经过多因子、正交试验设计工艺条件

2．浓缩与干燥

（1）浓缩措施：①盐析；②有机溶剂沉淀；③超滤；④真空浓缩或薄膜浓缩；

⑤离心冻干

（2）干燥：①低温真空干燥；②喷雾干燥；③冷冻干燥

三、分离纯化措施：含量低、易变性、环节多、多维组合，逐层分离（1）粗品分离：盐析，分级沉淀，萃取，超滤（2）分离纯化：多种色谱层析法（3）精制：亲和层析，HPLC，FPLC，电泳或等电聚焦四、分离纯化原理：1．根据分子极性与溶解度大小2．根据分子形状与分子大小3．根据电荷差别4．根据吸附特征5．根据生物配基特征第三节生物技术药物制造技术基础

Basisofbiotechdrugpharmaceuticaltechnolog一、基因工程制药技术基础（一）重组DNA技术基本原理基因工程是经过体外重组将甲生物基因转入乙受体生物内进行体现的生物技术，涉及6个主要过程：（1）取得目的基因；（2）构建DNA重组体；（3）将重组体导入宿主细胞；（4）目的基因的克隆与鉴定；（5）目的基因的扩增与目的蛋白的体现。（6）目的蛋白的纯化与制剂

2．基因工程药物制造过程

转化取得目的基因→构建重组体→构建工程菌（或细胞）→克隆与鉴定

Upstream→扩大工程菌培养（或细胞）→纯化目的蛋白→除菌过滤→半成品检定→制剂→成品检定→包装

Downstream二、基因工程制药主要操作技术

（二）基因工程制药操作技术1．目的基因的取得（1）逆转录法：真核基因转录的hmRNA在原核不能直接体现（隐具有内函子），在原核中缺乏hmRNA后加工系统，故不能成为成熟的hmRNA,故要先纯化目的mRNA，再经过逆转录作用下合成SSDNA(SiglestranDNA)。①cDNA第一链的合成:以目的mRNA为模板（3’-poly…AAA）,以oliger-dT为引物，加入dNTP,在逆转录酶作用下合成SSDNA(SiglestranDNA).②cDNA第二链的合成:先用碱或RNaseH水解除去与SSDNA配正确mRNA得到cDNA第一链，作为合成cDNA第二链的模板，在DNA聚合Ⅰ（klenow片断）作用下，加入dNTP,从5’→3’合成带有发夹构造的U型DNA，以核酸酶S1切除U型构造，形成双链DNAdsDNA(cDNA)。图5目的基因的取得（2）经过PCR技术制备目的基因PCR（polymerosechainreaction）经典反应涉及①模板变性94℃以上（1～2′）(使DNA拆为单链)②退火50～55℃（1～2′）(使引物与模板配对)③延伸72℃（1～2′）由高温聚合酶催化从5’→3’延伸链长。一般可经过30次循环，合成一定量cDNA,错误率一般为0.25%。(扩增>105倍)已经有高温DNA聚合酶，故操作已自动化（PCR仪）（3）化学合成法在已知DNA序列或多肽的一般构造时，如链长在60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。2．DNA重组体的构建将目的基因与基因载体连接，构成重组体基因载体（Vector）有（1）E.coli载体如PBR322（非体现型载体）体现型：PUC质粒，PKK233-3，PET系统：PET28a，PET32（2）芽孢杆菌载体如PUB110pE194和pC194（3）链霉菌载体如PIJ101PSG5（4）λ噬菌体载体如λgt10(非体现型)λgt11(体现型)*非体现型用于构建克隆基因扩增与鉴定，体现型用于构建生产目的蛋白的工程菌。一般目的基因<10Kb，可选用质粒为基因载体，目的基因>10Kb，可选用λ噬菌体DNA为载体。cDNA与载体连接措施

同聚尾连接法

用3’-脱氧核苷末端转移酶，使cDNA与载体DNA3’末端带上互补同型多聚体序列：

如质粒-poly-C（或A）

cDNA-poly-G(或T)两者退火后，经T4DNA连接酶封口，构建重组体。3’脱氧核苷转移酶cDNAcDNA-polyA(C)dNTP载体DNA-polyT(G)②人工接头连接法用T4DNA连接酶在平端上连接上人工接头，再用工具酶切开成粘性末端。目的基因 +cDNA接头工具酶（内限性内切酶）3．重组体的体现系统体现方式常用有①胞浆内体现②分泌体现③周质体现（1）原核体现系统①E.coli；②芽孢杆菌Bacillus；③链霉菌StreptomycesE.coli体现系统的优点：①易大量生产，成本低，②周期短，相对较安全，已公认可供大量生产。缺陷：①多为胞内体现、纯化困难，②易生成涉及体，复性困难，③产物多为AuG(Met)起始密码，④有内毒素污染的可能。（2）真核体现系统1）酵母属单细胞真核生物非分泌型载体如PA815,PPIc2,分泌型PHIL-S1优点：①易培养②无毒性③可分泌体现④产物可糖基化常用酵母体现体系①酿酒酵母（Saccharomycescoeviviae）体现，②毕赤酵母（pichiapsatoris）特点：①开启子为AOX1,属乙醇氧化酶I基因,受甲醇诱导②易高密度发酵,达100g/L(10%)已成功用于体现INFα,乙肝表面抗原疫苗,Ins,Aibumin2）动物细胞体现体系A哺乳动物细胞CHO(病毒质粒为载体)B昆虫细胞——家蚕细胞,如生产INFα4．体现与体现产物的纯化（1）选择高效体现工程菌，优化发酵条件（培养基构成，接种量，温度，溶氧，pH，诱导作用，发酵动力学）进行扩大发酵.（2）分离纯化要求：①技术条件要温和②选择性要高③收率要高④环节要少，时间短E纯度>95%。体现产物流程

*inclusionbodies由体现产物重组蛋白,宿主蛋白和膜蛋白构成，以体现产物为主，其一级构造正确，但空间构造错误，没有活性，不溶于水，可低速离心搜集包涵体，用变性剂SDS尿素，盐酸胍溶解，再稀释透析除去变性剂，使其复性。为预防或降低涉及体的形成常用措施：（1）降低培养温度从37℃降到30℃可明显降低涉及体形成率。（2）以硫氧还原蛋白为载体进行融合体现。硫氧还原蛋白是E.coil的一种同源蛋白，定位于粘附区，富含-SH,可保目的蛋白不发生分子错误折叠，是一种热稳定蛋白，体现产物汇集于粘附区，经过振扰提取使产物进入介质中，再酶解就得到目的蛋白。二、酶工程制药技术基础1、什么是酶工程（1）酶的发觉，分离，纯化与酶制剂的工业化应用。（2）酶与细胞的固定化技术与酶反应器。（3）生物酶工程：以基因工程技术和蛋白质工程技术研究酶工程。（4）酶工程技术的工业化应用。2、优点（1）固定化稳定性提升（2）可反复使用，提升使用效率，降低成本（3）提升强度，便于连续化，自动化，规模化生产（4）便于产物的分离、纯化3、制备措施：吸附法，包埋法、共价键结正当、交联法（1）包埋法：将酶或细胞定位于凝胶高聚物网络中，如卡拉胶，海藻胶，聚丙烯酰胺如用卡拉胶固定L-苹果酸合成酶生产L-苹果酸，卡拉胶加水（加热）溶解成5%（冷却40℃）加入产酶菌体（搅拌均匀）冷却（冷冻）切块（1-2CM2）KCl固化装柱（2）共价键结正当：酶分子与载体分子，经过化学偶联使酶与载体共价结合，一般纯酶固定化，用此法合用批量小，附加值高的产品生产。如用CNBr活化纤维素载体再与酶蛋白共价结合。利用固定化胰蛋白酶亲和层析制备胰蛋白酶克制剂（3）交联法：用双功能试剂，将酶与载体交联固定化如用二醛和明胶交联固定化前列腺素合成酶合成PGE1，PGE24固定化酶性质：（1）经过固定化酶活一般下降，因酶的空间构造发生变化，或酶与底物结合时有空间位阻，所以要测定固定化酶的体现活力，再计算总活力，并与使用半衰期的延长时间，统计分析固定化工艺的有效性（2）提升稳定性，因固定化酶体现活力下降，但稳定性提升，所以其稳定性和测定对评价工艺效益十分主要，半衰期t1/2=0.693KDKD=2.303lg(ED)/(E)为起始活力，[E]为时间t后残留活力。故经常要研究E的操作，储存稳定性或对pH对热的稳定性和对蛋白酶的稳定性。经过E一般能够提升稳定性（涉及对温度，pH，蛋白酶，变性剂和克制剂的耐受程度）所以有利工业化的连续化与自动化应用。所以在生物工艺中就得到广泛应用。如制造r-氨基丁酸，天冬氨酸，L-苹果酸，丙氨酸，色氨酸，苯丙氨酸等。还用于从丙烯氰生产丙烯酰胺

第四节生物制药工艺中试放大设计

一、中试放大目的与规模

1．目的：（1）建立稳定工艺、大批量制备足量合格产品，供给临床前与临床研究；

（2）研究工艺参数制定工艺规程和检定规程，为正式生产提供工艺参数，确保能在后来生产中应用。

二、规模：

中试是由小试转入工业化生产的过渡性研究，是取得成功产业化的关键。

三、中试放大特点1、改善小试操作，稳定工艺2、提升收率，提升产品质量3、降低消耗，拟定原辅料质控原则4、形成批量生产，制定制造规程和检定规程四、中试放大时应具有的条件（1）有稳定的工艺：收率，质量可靠（2）操作条件基本确立（3）已建立中间品和成品分析措施（4）生物材料已鉴定（5）物料平衡、三废处理已基本处理（6）中试规模、产品产量，规模已拟定（7）安全生产已经有方案五．中试放大要处理的问题（1）原辅材料规格（2）设备选型与材质选用（3）反应条件（4）原辅料中间品、产品质控原则与检定措施（5）下游工艺优化与稳定制造规程的