基因、标志物、蛋白质组学的临床检测应用20111028

基因、标志物、蛋白质组学

的临床检测应用中南大学湘雅三医院袁洪BreakthroughoftheYear2007

《Science》杂志2007年度科学研究十大突破HumanGeneticVariation(人类遗传差异)REPROGRAMMINGCELLS(细胞重组)TRACINGCOSMICBULLETS(高能宇宙射线)RECEPTORVISIONS(人体蛋白受体结构)

BEYONDSILICON?(新电气材料)ELECTRONSTAKEANEWSPIN(量子自旋霍尔效应)DIVIDETOCONQUER(T细胞分化)

DOINGMOREWITHLESS(化学合成)BACKTOTHEFUTURE(大脑的记忆与联想)

GAMEOVER(人工智能)

BreakthroughoftheYear2008

CellularReprogramming(细胞重组)

SeeingExoplanetsCancerGenes（癌症基因）NewMysteryMaterialsWatchingProteinsatWork（观察蛋白质工作）WatertoBurnTheVideoEmbryoFatofaDifferentColorProton'sMass'Predicted'SequencingBonanza（更便宜的测序技术）Science杂志公布的2008年度科学研究十大突破，诊疗技术创新占据了4项始祖种地猿化石Fermi所探测到的脉冲星

雷帕霉素：研究人员发现，对一种关键性的

信号通路进行调节可在小鼠身上产生延年益寿石墨烯：

植物的ABA受体世界首个X射线激光基因疗法的卷土重来：将基因疗法与血液干细胞疗法相结合的策略它可能成为治疗某种致命性脑病的有用工具

单极子

LCROSS月球探测器对哈勃太空望远镜的修复：

BreakthroughoftheYear2009

2010年科学热点预测，癌细胞的代谢、Alpha

磁分光计、外显子测序与疾病、多能干细胞治疗神经精神性疾病\人类太空飞行

BreakthroughoftheYear20101.第一个量子机械：2.合成生物学:3.尼安德特人基因组:4.HIV预防:5.外显子组测序/罕见疾病基因:6.分子动力学模拟:7.量子模拟器:8.下一世代的基因组学:9.RNA的重新编程:10.大鼠的回归:20世纪生命科学取得了两次革命性进展：分子生物学的成熟和计算机科学的发展21世纪生命科学基础研究中最活跃的前沿主要包括：分子生物学、细胞生物学、神经生物学、生态学___引伸出如基因组学、蛋白质组学、结构基因组、克隆、脑与认知、生物多样性等重要领域8基础研究的问题92003-2006年，美国国立健康研究院（NIH）投入15亿美元用于肿瘤的基因治疗，获得25000篇研究论文1970年至今，全球投入超过4000亿美元的可研经费和大量人力用于肿瘤的研究，获得156万篇研究论文获得临床应用极少肿瘤死亡率未明显降低原因1.临床实际问题提出者往往缺乏较好科研思维不具备良好研究条件2.大量基础研究偏离临床实际难以在临床上应用10如何拆除基础研究与临床应用之间的障碍?111992年ChoiDW.在《Science》杂志首次提出“从实验室到病床(BenchtoBedside)”的概念。1996年GeraghtyJ.在《Lancet》杂志第一次提出了“转化医学”这一新名词2003年美国国立卫生研究院(NIH)的Elias.Zerhouni在《Science》首先全面阐述转化医学概念，其典型含义是将基础研究成果转化为有效的临床治疗手段，强调从实验室到病床旁的连接，通常称之为“从实验台到病床旁”转化医学概念延伸主流观点:是将“从实验室到临床使用的应用型研究“

较强实验室研究基础，结合较多相关边缘学科技术支持

延伸：“将研究结果、结论应用到日常临床及健康保健工作中”

医学科学普及：将成果应用到每个个体之中

12疾病临床诊断采用分子生物学（包括基因组学、蛋白质组学和代谢组学）和细胞生物学技术，将同一疾病的病人进行遗传学上（基因突变、基因多态性等）的分类，对疾病的进展进行分期，并实行全程监测，通过往复式的研究，获得用于疾病临床诊断

从机体表型来认识疾病,即根据现象和检查所获知的症状与体征。从组织细胞的病理、生理变化来分析和诊断疾病。不能从本质上真正认识疾病发生的根本原因,不能从根本上治愈疾病和阐明疾病的发病机制人类对疾病的认识致病有机体人体内部系统自身紊乱（微生物寄生虫等）（如：malaria）原核真核胞膜、胞浆胞核（染色体等）蛋白、糖、脂核酸（DNA、RNA等）分子水平组织胞膜、胞浆（包括线粒体等），胞核（染色体等）蛋白、糖、脂核酸（DNA、RNA等-）化学物、空气等机体水平(组织）细胞水平亚细胞结构细胞人体疾病HumanDiseasemicroRNA,siRNA外伤Trauma现代分子医学形成了一系列交叉学科

如分子遗传学、分子免疫学、分子病理学、分子血液学、分子肿瘤学、分子病毒学、分子流行病学等

解释和研究不同的病理、生理现象，甚至治疗不同的疾病

基础医学中不断出现新的边缘学科，如分子生理学、分子药理学、分子病理学、分子遗传学、分子免疫学、分子病毒学、分子肿瘤学、分子神经生物学等分子医学（molecularmedicine）：由于分子生物学渗透进入生物学和医学的每一分支领域，全面推动了生命科学和医学的各个方面的发展，如疾病的发病机理研究、疾病的诊断和治疗，使医学进入了一个崭新的时代。

（一）功能基因组学和蛋白质组（二）克隆技术与干细胞（三）转基因生物

（四）生物信息学生命科学和生物技术的前沿领域生化学诊断：常规生化血清免疫学诊断：抗体、抗原、细胞因子、肿瘤标志物基因检测：遗传、心脑血管、肿瘤、病原体

蛋白质组学：功能蛋白、多肽检测实验室检测指标分类不同层次检验分析分子水平(molecular)---群体、更体现个体生化水平(biochemistry)---生理、病理生理细胞水平(cell)+分子水平组织水平(tissue)+分子水平个体水平(individual)---分子水平群体水平(population)---生化水平、细胞水平、组织水平从整体水平到分子水平示意图分子水平细胞水平整体水平

生命科学的发展过程：技术与方法的进步酶标荧光放免发光灵敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9

1.反映心脏组织损伤的标志物2.了解心脏功能的标志物3.作为心血管炎症疾病的标志物

临床应用的心脏标志物25肌钙蛋白复合体发现于1965年，是心肌收缩调节蛋白20世纪90年代初，Katus在牛、猪、犬的心肌中都发现肌钙蛋白高表达，其与骨骼肌的交叉反应仅为1%~2%。经典案例：肌钙蛋白26美国Landenson在1992年发现肌钙蛋白在诊断急性心肌梗死具有高敏感性，高特异性目前，肌钙蛋白已经成为最简单、准确的诊断心肌梗死的“金标准”之一27日本学者Sudon等在1988年首先从猪脑中分离出这种物质

1989年，SaitoY发现BNP具有利钠利尿、血管舒张、抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统与抗利尿激素的分泌，抑制交感神经的传出冲动等经典案例：BNP28ErnbergT发现其对心血管结构和功能的改变具有一定的特异性和敏感性，与心力衰竭等心血管疾病关系密切目前BNP已经成为应用最广泛的诊断心力衰竭的标志物转基因的BNP已成为目前治疗急性心衰和重症心衰有效药物（1）鉴别心源性还是肺源性（2）评价心脏功能，判定心衰严重程度（3）心血管疾病预后估计和危险性分类（4）治疗效果的监测,调整药物剂量（5）其他，如高危人群筛查

心脏利钠肽的主要临床用途有：C反应蛋白（CRP）等炎症标志物在心血管疾病中的应用受到广泛重视CRP是动脉粥样硬化、血栓形成疾病的介导和标志物心血管炎症疾病的标志物血浆超敏C反应蛋白（hs-CRP），前瞻性的研究显示：对于早期无症状患者，CRP水平增加与冠脉事件、中风及周围血管病相关联，是一种独立的危险因素炎症标志物与冠心病血循环中的白细胞介素-6（IL-6）与CRP良好相关，故也可作为反映预后的指标

可溶性细胞间黏附分子(sICAM-1)反映炎症细胞因子水平的升高，与炎症、血栓形成和纤溶有关肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的作用是刺激IL-6和sICAM-1等白细胞黏附分子的表达。血浆纤维蛋白原升高与冠脉事件风险的关系美国研究表明：

Hcy的升高是与中风有重要关联的危险因子。美国最新的数据显示中年后期男性中风发病率，处于55-64这个年龄段的男性相对于45-54年龄段的男性而言，前者患中风的几率是后者的三倍－《中风和脑血管疾病》杂志2008；17；165-168“美国中年后期的男性发生中风的相关因子急剧增加”心脏标志物常常表现为多种临床病症，如心肌缺血损伤时除hs-CRP和CKMB增高，心脏利钠肽在ACS不同阶段也可出现异常变化

心脏标志物合理的联合应用正在引起重视，有利于提高心脏生物标志物临床应用的灵敏性和特异性心脏标志物的联合应用TM的分类TM主要分为两类：肿瘤组织产生的和肿瘤与宿主相互作用而产生的。或大致分为以下几类：１.由肿瘤细胞分泌的标志物１）分化抗原标志物２）胚胎抗原标志物（AFP、CEA等）３）糖脂或糖蛋白类(CA19-9、CA15-3、CA242等）４）同工酶类标志物（NSE,PAP,CK-BB等）5）激素类标志物（HCG,ACTH等）6）肿瘤相关抗原（PSA，TPA等）7）基因类标志物（P53、C-MYC、BCL－2）8）其它：多胺、唾液酸等２.宿主反应标志物SF、β２-MG、IL-2R、TNF

3.不进入体液的标志物TM的分类CancerBiomarkerandTypesofCancer:statisticallysignificantassociationbetweenaparticularcancerandtheassociatedcancermarker(s)AFP=alphafetoproteinCEA=carcinogenicembryonicantigenCA15-3=carbohydrateantigen15-3CA19-9=carbohydrateantigen19-9CA125=carbohydrateantigen125PSA=freeprostatespecificantigen+prostatespecificantigen-alpha(1)antichymotrypsincomplexPSAF=freeprostatespecificantigenPSAC=prostatespecificantigen-alpha(1)antichymotrypsincomplexPAP=prostaticacidphosphatasehTG=humanthyroglobulinhCGb=humanchorionicgonadotropinbetaFerr=FerritinNSE=neuronspecificenolaseIL-2=interleukin2IL-6=interleukin6A2M=alpha2macroglobulinB2M=beta2microglobulinProblemsofCancerBiomarkerNocancerbiomarkerisabsolutelyspecificNocancerbiomarkertestisfreeoffalsenegativesNocancerbiomarkertestisfreeoffalsepositivesNocancerbiomarkerisabsolutelyspecificNocancerbiomarkertestisfreeoffalsenegativesNocancerbiomarkertestisfreeoffalsepositivesTM的临床应用普查：迄今为止还没有一种理想的TM，用于普查受到限制定位:TM基本上不能对肿瘤进行定位，因为绝大多数TM都无器官特异性确诊：任何一种TM都存在假阳性和假阴性的问题分期：大多数TM与疾病的分期有关，且浓度与肿瘤的大小或分期有关系。几乎所有的TM在肿瘤晚期时均呈现较高的浓度与治疗关系１）如化疗、放疗或手术后立即测定TM浓度，可能会有短暂的升高，与肿瘤细胞坏死相关2）化疗、放疗或手术后TM浓度持续恒定升高，可能表示治疗无效预后：部分TM对肿瘤具有预后价值,如术前TM浓度增加,术后浓度减低,则可能预后较好TM联合检测的常用组合1、肝癌：AFP+AFP异质体2、食道鳞癌：CYFR21-1（细胞角蛋白19片断）+TPS（组织多肽特异抗原）+SCC（磷状细胞相关抗原）食道腺癌：CA199+CEA+TPS3、胃癌：CA724+CEA+CA1994、结直肠癌：CA242+CEA+CA199+TPS5、胰腺癌：CA242+CA1996、乳腺癌：CA153+CEA+CA1997、卵巢癌：CA125+CA724+TPS+AFP8、宫颈癌：SCC+CYFRA21-1+TPS（1）遗传疾病诊断及部分疾病早期诊断及预测（2）基因治疗（3）基因预防（4）药物个体化的实施

基因诊断

核酸的分子生物学主要研究核酸的结构及其功能。核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此形成了分子遗传学。核酸分子生物学：

分子遗传学：形成了比较完整的理论体系和研究技术，它是目前分子生物学中内容最丰富、研究最活跃的一个领域。基因的概念遗传因子，“一个因子决定一个性状”。“基因论”，基因是直线排列在染色体上的遗传颗粒三位一体的概念：携带生物体遗传信息的结构单位。控制一个特定性状的功能单位。突变单位和交换单位。“一个基因一个酶”“一个顺反子，一条多肽链；一个基因一条多肽链

美国科学家、诺贝尔奖获得者DulbeccoR于1986年在美国《Science》杂志上发表的短文中率先提出，并认为这是加快癌症研究进程的一条有效途径。主要的目标是绘制遗传连锁图、物理图、转录图，并完成人类基因组全部核苷酸序列测定。测出人体细胞中23对染色体上全部30亿对核苷酸的序列，把所有人类基因都明确定位在染色体上，破译人类的全部遗传信息。

HGP是人类自然科学史上与曼哈顿原子弹计划和阿波罗登月计划相媲美的伟大科学工程。人类基因组计划（humangenomeproject,HGP）研究结果人类基因数量仅有3万个左右。发现男女可能存在巨大遗传差异，男性染色体减数分裂的突变率是女性的两倍。发现许多与遗传病有关的基因，包括乳腺癌、遗传性耳聋、中风、癫痫症、糖尿病和各种骨骼异常的基因。基因芯片技术:将大量探针固定于支持物上，与标记的样品进行杂交。可一次性对样品中大量序列进行检测和分析。解决了传统核酸杂交技术操作繁杂、检测效率低的问题。通过设计不同的探针阵列和使用特定的分析方法，使该技术具有多种不同的应用价值。如基因表达谱分析、基因突变检测、多态性分析、基因诊断等。基因芯片（Genechips）技术：基因检测在感染性疾病中的应用SARS相关冠状病毒的分子诊断2003年4月，香港研究者Peiris等报告了50例SARS病人的临床表现和病毒学研究结果一种新的冠状病毒(Coronavirus)是SARS的致病原因

-Lancet,2003,361:9365肝炎病毒基因的检测

临床价值主要体现在：病情评估

血清中病毒含量的多少与肝脏病理损害程度相关，病毒载量越高，肝组织炎症反应程度越重疗效预测

治疗前病毒核酸载量越高，疗效越差；载量越低，机体清除病毒的可能性越大病毒分型和耐药检测各个编码区段存在着大量有意义的自然变异或药物诱导的变异，并由此产生不同的变异株，从而导致HBV感染的不同血清学和临床表现检测HBV的变异株对了解疾病机制、药物耐受和指导用药有一定的价值预后判断病毒核酸载量持续处于高浓度者预后不良垂直传播途径感染者，预后较差反映肝细胞损害的其它指标正常，但病毒核酸水平经常波动者更易发展为肝硬化基因检测在监测移植物排斥中的作用

BK病毒感染已经成为肾脏移植远期失败的重要原因之一

BK病毒感染越来越受到关注遗传性疾病基因诊断的策略（一）直接诊断策略 基因诊断的直接策略是通过各种分子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明直接诊断由于是直接揭示遗传缺陷，因而比较可靠

（二）间接诊断策略

间接诊断的实质是在家系中进行连锁分析，通过分析可确定个体来自双亲的同源染色体中的哪一条为致病染色体，从而判断该个体是否带有致病基因间接诊断不是寻找DNA的遗传缺陷，而是通过分析DNA的遗传标记的多态性估计被