姜辣素抗小鼠胃溃疡作用及其机制研究

姜辣素抗小鼠胃溃疡作用及其机制研究

溃疡是一种慢性溃疡，发生在门户和幽门之间。这是一种常见的临床疾病，通常是罕见的。据统计，约11%的人一生中患有疾病。此病若不能及时对症治疗很容易发生穿孔、出血、梗阻以及胃溃疡癌变,给患者身心带来极大痛苦。现代用来控制胃溃疡的方法主要是使用质子泵抑制剂和组胺H2受体阻滞剂来抑制胃酸分泌,但从长期的临床治疗上来看有很多不利影响和复发的报告。生药姜具有开胃止呕,化痰止咳,发汗解表的性能,姜辣素是生药姜中一些具有辣味物质的总称。其主要成分为6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚。本文作者应用了现代药理学研究手段,通过考察姜辣素对幽门结扎法致胃溃疡模型和阿司匹林致胃溃疡模型的作用,初步探讨其作用机制。1实验仪器与试剂SX721分光光度计(山东高密彩虹分析仪器有限公司),J2-HS型低温超速离心机(美国BECKMAN公司),JC-1200γ放射免疫计数器(中国科技大学科技实业总公司中家光电仪器分公司),RE-2000A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),微型植物试样粉碎机(北京市永光明医疗仪器厂),202-2AB型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司),KH-250B型超声清洗器(昆山禾创超声仪器厂)。姜辣素(由沈阳药科大学中药学院提供),体内实验时,用体积分数为40%的聚乙二醇400(polyethyleneglycol400,PEG400)溶液配制,米索前列醇(misoprostol,MPS,湖北葛店人福药业有限责任公司,批号:081207),酚酞(天津市博迪化工有限公司,批号:20050607),氢氧化钠(沈阳市正信高科技研究所试剂部,批号:20050327),阿利新兰8GX(美国Amresco公司),柠檬酸(沈阳正信高科技研究所试剂部,批号:20040327),磷酸氢二钠(广东汕头市西陇化工厂,批号:0503071),6-keto-PGF1α放免试剂盒(中国人民解放军总医院科技开发中心,批号:200908),消炎痛EDTA·Na2(中国人民解放军总医院科技开发中心)。昆明种小鼠,体质量25～30g,雌雄各半,由沈阳药科大学实验动物中心提供,质量一级合格,实验动物生产许可证号:SCXK(辽)2003-008。2方法2.1姜辣素的制备2.1.1超声辅助提取取鲜生姜若干置于干燥箱中于60℃干燥至恒质量,用粉碎机粉碎过0.3mm筛,粉碎过的样品置于烧杯中,以体积分数为60%的乙醇溶液为溶剂,质量浓度80g·L-1条件下超声处理15min,布氏漏斗抽滤,取滤液,低压浓缩回收乙醇,得姜辣素粗提物。2.1.2洗脱溶液浓缩处理好的大孔吸附树脂,用量为m(姜辣素粗提物)∶m(干树脂)=4∶100,洗脱溶剂为V(正己烷)∶m(乙醇)=7∶3,洗脱速度:0.4mL·min-1,将洗脱得到的洗脱液浓缩,得姜辣素。经分析姜辣素的纯度质量分数为63.44%,姜辣素的主要成分为6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、姜酮及姜烯酚。其中,6-姜酚约占53%,8-姜酚约占13%,10-姜酚约占30%,姜酮和姜烯酚低于1%。2.2抗幽门扎法对大鼠胃不好2.2.1小鼠胃损伤指数gk-1、姜辣素检测昆明种小鼠60只,体质量25～30g,雌雄各半,随机分为6组,即溶剂对照组和模型组(灌胃给予体积分数为40%的PEG400溶液)、米索前列醇组(0.14mg·kg-1)、姜辣素低剂量组(73mg·kg-1)、姜辣素中剂量组(145mg·kg-1)、姜辣素高剂量组(290mg·kg-1)。每天灌胃给药1次,连续7d,第六天给药后禁食24h,自由饮水。末次给药1h后,除溶剂对照组外,其他各组小鼠乙醚浅麻醉,行幽门结扎术。术后20h处死小鼠,取出全胃,观察胃黏膜损伤情况,并计算各组小鼠胃损伤指数及溃疡抑制率。判定标准:点状溃疡(直径小于1mm的溃疡),3个点计1分;长条状出血溃疡(直径大于1mm的溃疡),宽度在1mm之内者则按长度计分每1mm长计1分,如宽度大于1mm者按长度加倍计分。溃疡抑制率(%)=(模型组溃疡指数-给药组溃疡指数)/模型组溃疡指数×100%。2.2.2保肝活性氧测定昆明种小鼠50只,体质量25～30g,雌雄各半,随机分为5组,即模型组(灌胃给予体积分数为40%的PEG400溶液)、米索前列醇组(0.14mg·kg-1)、姜辣素低剂量组(73mg·kg-1)、姜辣素中剂量组(145mg·kg-1)、姜辣素高剂量组(290mg·kg-1)。小鼠每天灌胃给药1次,连续7d,第六天给药后禁食24h,自由饮水。末次给药1h后,各组小鼠乙醚浅麻醉,剖开腹壁,行幽门结扎术。手术20h后结扎贲门,处死小鼠,取出全胃,将胃液倒入试管中,离心10min(3000r·min-1),取上清液进行胃液总酸度、胃蛋白酶活性和游离黏液量的测定。胃液总酸度的测定方法:取上清胃液0.2mL,加0.2mL蒸馏水稀释,稀释液加10g·L-1酚酞50μL,以0.01mol·L-1NaOH滴定至终点(溶液显粉红色,且30s内不变色),记录消耗的NaOH的体积,计算胃液总酸度。胃液总酸度(mmol·L-1)=NaOH消耗量(mL)×50。胃蛋白酶活性的测定方法:取上清胃液0.2mL置于具塞试管中,加0.05mol·L-1盐酸稀释至3.0mL。将预先做好的两根长2.0cm的蛋白管(取内径为1.0mm的玻璃毛细管,灌满新鲜蛋清,放入85℃水中,待蛋清凝固后取出、冷却,截去两端透明的部分)置于试管中,将试管放入37℃恒温水浴中孵育24h之后取出,用游标卡尺测量蛋白管两端透明部分的长度(mm),求出透明部分长度的平均值,计算胃蛋白酶活性。胃蛋白酶活性单位(mol·s-1)=平均值2×16。游离黏液量的测定方法:取上清胃液0.2mL,加10g·L-1阿利新兰溶液0.02mL,pH5.8柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液0.66mL,再加蒸馏水至1.0mL,混匀,于20℃室温静置24h后,离心10min(2500r·min-1),取上清液,于可见分光光度计615nm波长处测定吸光度值(OD值)。空白管为pH5.8柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液,标准管为0.2g·L-1的阿利新兰溶液。计算游离黏液所结合染料量。游离黏液量(g·L-1)=1.0-样品管OD值/标准管OD值。2.3阿司匹林对大鼠胃的影响2.3.1米索自组织米索前药昆明种小鼠60只,体质量25～30g,雌雄各半,随机分为6组,即溶剂对照组和模型组(灌胃给予体积分数为40%的PEG400溶液)、米索前列醇组(0.14mg·kg-1)、姜辣素低剂量组(73mg·kg-1)、姜辣素中剂量组(145mg·kg-1)、姜辣素高剂量组(290mg·kg-1)。给药0.5h后,模型组、米索前列醇组、低剂量组、中剂量组、高剂量组分别灌胃给予阿司匹林100mg·kg-1,小鼠每天灌胃给药1次,连续7d,第六天给药后禁食24h,自由饮水。末次给药1h后,处死小鼠,迅速剖取胃,洗净内容物,观察胃黏膜损伤情况,并计算各组小鼠胃损伤指数。判定标准同“2.2.1”条。2.3.2胃壁结合染料量的测定昆明种小鼠60只,雌雄各半,分组及给药方法同“2.2.1”条。末次给药1h后,将小鼠处死,迅速剖取胃,洗净内容物,于滤纸上吸干水分,将整个胃组织浸于用pH5.8柠檬酸-磷酸二氢钠配制的阿利新兰溶液(0.2g·L-1)8.0mL中,室温下静置3h,而后离心10min(1500r·min-1),取上清液进行比色测定。标准管为0.2g·L-1的阿利新兰溶液。计算胃壁结合染料量。结合染料量(mg)=1.6-(对照管OD值/标准管OD值)×1.6。2.3.3小鼠血清学检测昆明种小鼠60只,雌雄各半,分组及给药方法同“2.2.1”条。末次给药1h后经小鼠眼球后静脉丛取血1.0mL,注入含有消炎痛EDTA·Na2的试管中,混匀,离心15min(3500r·min-1),分离血浆。按血浆6-keto-PGF1α试剂盒说明进行操作,用JC-1200γ放射免疫计数器进行放免测定。2.4统计分析数据以均值加减标准差(ˉx±s)表示,采用SPSS13.0软件应用组间t-检验进行统计学分析,以P<0.05为显著性差异。3结果3.1抗幽门结防止老鼠溃疡3.1.1姜辣素对小鼠推进理成单、确立溃疡抑制的实验结果实验结果显示:模型组小鼠胃溃疡(Ulcerindex,UI)指数高,损伤严重,与溶剂对照组相比具有统计学意义(P<0.001);姜辣素各组小鼠UI指数低,损伤不严重,与模型组相比具有统计学意义(P<0.01,P<0.001),溃疡抑制(Inhibition,I)率随剂量增大而提高。实验结果见表1。a—P<0.001comparedwithcontrol;b—P<0.01;c—P<0.001comparedwithmodel3.1.2两组小鼠胃肠总酸度比较,见表1实验结果显示:姜辣素各组小鼠胃液(gastricjuice,GJ)分泌量明显减少,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.001);姜辣素中剂量组和高剂量组小鼠胃液总酸度(gastrictotalacidity,GTA)明显降低,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.001)。与模型组比较,姜辣素各组小鼠胃蛋白酶(pepsin,P)活性无显著差异(P>0.05)。实验结果见表2。a—P<0.05;b—P<0.01;c—P<0.001comparedwithmodel3.1.3两组病料游离处理量比较实验结果显示:姜辣素中剂量组和高剂量组小鼠胃液游离黏液量(freemucus,FM)增加,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.001)。实验结果见表2。3.2阿司匹林对大鼠胃的影响研究3.2.1对小鼠胃损伤指数的影响实验结果显示:阿司匹林模型组小鼠胃损伤指数高,损伤严重,与溶剂对照组相比差异具有统计学意义(P<0.001);姜辣素中剂量组和高剂量组小鼠胃损伤指数低,损伤不严重,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.001)。实验结果见表3。3.2.2两组小鼠胃肠结合效率4.0.05的比较实验结果显示:阿司匹林模型组小鼠胃液结合黏液量(mucus,M)低,与溶剂对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);姜辣素高剂量组小鼠胃液结合黏液量高,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。实验结果见表3。3.2.3小鼠血浆6-keto-pgf1水平实验结果显示:阿司匹林可使小鼠血浆6-keto-PGF1α水平降低,较溶剂对照组有显著差异(P<0.001)。姜辣素组小鼠血浆6-keto-PGF1α水平较模型组显著升高(P<0.001)。实验结果见表3。a—P<0.05;b—P<0.001comparedwithcontrol;c—P<0.05;d—P<0.01;e—P<0.001comparedwithmodel4姜辣素对胃黏膜酶的活性目前关于胃溃疡发病机制的学说有很多,其中shay等人提出的“天平学说”——攻击因子与防御因子失衡最为合理,攻击因子主要指胃酸、胃蛋白酶等;防御因子主要包括胃黏膜血流、碳酸氢盐、黏液分泌、细胞膜的完整性、细胞的再生等。本文作者采用幽门结扎法致溃疡模型,其机制是通过刺激幽门胃窦黏膜的压力感受器,引起迷走神经反射,通过促胃液素,作用于壁细胞,引起胃液分泌。又由于结扎后胃液不能顺利进入十二指肠,而使胃液滞留于胃内。胃液中的胃酸可以激活胃蛋白酶原,使之转变为有活性的胃蛋白酶。当胃腔中H+在局部大量聚集,分解黏液层中的碳酸氢盐,最终破坏胃黏膜上皮细胞之间的紧密连接,削弱胃黏膜屏障,从而形成溃疡、糜烂或出血。从本文作者研究姜辣素的实验结果可以看出:姜辣素各剂量组小鼠溃疡指数显著低于模型组,不仅如此,姜辣素中高剂量组的胃液分泌量与胃液总酸度也有明显降低,胃蛋白酶活性也有降低的趋势,证明姜辣素对于胃酸和胃蛋白酶攻击因子加强确实有抑制作用;另外,姜辣素中高剂量能显著促进胃液游离黏液量的分泌,胃液中的游离黏液虽对胃黏膜已无保护作用,但游离黏液的含量反应了黏膜上皮细胞黏液更新速度的快慢。实验结果提示姜辣素可使胃黏膜表面黏液的更新速度加快,胃黏液分泌增加,胃黏液-碳酸氢盐屏障功能增强,使胃黏膜自身防御因子水平提高,起到抗损伤的作用。阿司匹林致胃溃疡的形成是由于阿司匹林抑制胃黏膜环氧化酶,使前列腺素(prostag