烟草青枯病生防菌的筛选与应用

烟草青枯病生防菌的筛选与应用

草青霉病是由布科杆菌引起的草土壤传播疾病。这种病原菌在高温多雨的天气中易于发生,主要侵染烟株根部,从而使烟草枯萎。传统上,防治烟草病害是直接使用化学药剂,这样不仅破坏了土壤微生态平衡而且也使烟叶品质逐年下降,所以有机肥的研究和施用在烟叶生产中越来越受到重视。施用有机肥不但可以改善土壤的理化性状和营养状况,而且有机肥和无机肥配合施用还可以提高烟叶产量和质量。从病害的原位土壤中分离筛选出对病原菌具有拮抗效果的微生物制成生态有机肥来防治土传病害,在防病的同时还可以改善和修复土壤生态环境,减少化学肥料和农药的使用,以实现烟草生产的可持续发展。有关生物防治植物病害和利用堆肥降低农作物病害已有大量报道,近年来Hoitink等利用堆肥改良的盆栽基质成功地防治了许多土传植物病害,但是由于受到环境因素、堆肥材料以及堆肥的腐熟程度等因素的影响,这种方法不易被广泛应用。有关拮抗菌的防病研究也取得了一些成效,拮抗菌可以阻止病原菌的增殖,具有较好的生防前景,但目前还处在实验室研究阶段,进入实际生产的几乎没有。本研究目的就是开发一种具有生物农药功能的烟草专用生物有机肥来防治烟草青枯病,进而探索出一种可替代化学农药防治某些植物病害的有效途径。1材料和方法1.1病毒本实验室筛选的青枯病病原菌的拮抗菌株暂命名为T5,其基本生物性状见参考文献。1.2堆肥原料的堆高堆肥所用牛粪来源于河南省花花牛奶牛繁育中心,玉米秸秆采自奶牛繁育中心周围的田地,两者的基本理化性状见表1。堆肥前将玉米秸切碎至2～3cm,按玉米秸秆与牛粪的重量比例为3∶7进行混合并调节混合后原料的水分至50%～60%,将堆肥原料自然堆高至120cm,堆体周围用草苫覆盖以保温和防止水分蒸发。堆肥过程中每周人工翻堆一次并根据堆肥原料的水分变化补充水分以维持堆肥含水率在50%～60%。当堆肥温度升至50℃后维持高温时间在10天左右以利用堆肥的高温实现对堆肥原料的无害化处理,之后将堆体翻开降温至40℃以下待用。1.3抗性突变株的筛选和抗逆性试验为了研究堆肥材料中拮抗细菌的浓度变化情况,需要寻找一种突变株以便于进行测定,向拮抗菌培养基中加入一定量的硫酸庆大霉素,通过浓度梯度平板法来诱变筛选拮抗细菌T5的抗性突变株T5-1,连续转接15代后做拮抗试验,检验突变菌的遗传稳定性。1.4硫酸庆大霉素菌株的筛选向堆温已降至40℃以下的堆肥中接入拮抗菌T5-1,接种量为108cfug-1(干基),用含有硫酸庆大霉素的细菌培养基检测其生长情况,以便鉴定接种成功与否。1.5发育阶段2000g自2005年3月至2005年8月分别于福建省邵武市和安徽省芜湖烟区进行功能性有机肥防治青枯病的田间试验。供试试验田为近年来青枯病发病较严重的地块,将拮抗菌株T5-1扩繁后接入堆肥中制成功能性有机肥,有效活菌数为108cfug-1(干基)以上。试验处理设置如下:A:常规施肥(CK);B:有机肥作基肥(20g株-1);C:有机肥作基肥(10g株-1)+有机肥作追肥(10g株-1);D:有机肥作追肥(20g株-1)。每处理小区烟株30株,3次重复。基肥于烟苗移栽时穴施,追肥于5月中旬青枯病发病开始期施用。待烟区大面积发生青枯病时对试验田中烟株青枯病发病率和发病指数进行调查。病级:0级为叶面无症状;1级为植株上1/4以下的叶面表现萎蔫症状;2级为植株上1/4～1/2叶面表现萎蔫症状;3级为植株上1/2以上叶面表现萎蔫症状;4级为全株萎蔫死亡。发病指数=∑(各级病株数×各级代表值)调查总株数×最高级代表值×100=∑(各级病株数×各级代表值)调查总株数×最高级代表值×100在2005年田间试验的基础上,2006年在福建省邵武市同一烟田地块进行了第二次试验,处理设置如下:A:常规施肥(CK);B:有机肥作基肥(250g株-1);C:有机肥作基肥(200g株-1)+有机肥作追肥(灌根50g株-1);D:有机肥作追肥(250g株-1)。本次试验,为了防止不同处理间的相互影响(传染),每小区之间以3行隔开,每个处理3次重复,每小区30m2,植烟50株,完全随机组排列。试验中除施用生物有机肥外,管理措施与其他田块相同,常规施肥中N∶P2O5∶K2O的比例为1∶1.5∶2,总氮用量为82.5kghm-2。2结果与分析2.1t5-1与t5菌种生长和抗性对比通过浓度梯度平板法得到的硫酸庆大霉素抗性突变细菌T5-1与T5菌种形态和生长情况相似。通过拮抗效果验证,得知二者的拮抗效果一致,如图1和图2所示。经过遗传稳定性检测,T5-1菌遗传稳定性较好。2.2堆肥中其他嗜温菌的生长从图3可看出,在堆肥高温(70℃)初期,堆肥嗜温细菌数量非常大,为1010cfug-1(干基),但当维持高温2周后,嗜温细菌数量降低,接近于105cfug-1(干基)。此时降低堆温至40℃后接种T5-1菌,接种量为108cfug-1(干基),此后堆肥保持恒温40℃,堆肥中其他嗜温菌和接种的菌株T5-1均快速生长,培养3d后获得嗜温菌和T5-1菌的浓度均达到约为1012cfug-1(干基)的高密度堆肥产品。试验结果表明,在堆肥生产过程中通过堆肥材料中易降解有机物质的分解,使堆温升高到50℃以上,保持高温2周即可消除堆肥原料中的病原菌以及其他嗜温性的土著微生物对拮抗微生物的影响;然后翻堆降温至40℃时,向堆肥中接种大量的抑制烟草青枯病的拮抗菌,保持堆肥温度在40℃左右使接种的拮抗菌利用堆肥中尚存的易分解有机物进行繁殖。这样在向烟田施加有机肥的同时也带入了大量的拮抗细菌,使得烟草在具有大量病害拮抗细菌的土壤中生长,从而防止病害的发生。2.3对田间病员防治的影响2005年福建省烟株生长的中后期雨水偏多也较为集中,因而青枯发病率也较以往偏高,发病速度也快。而安徽芜湖烟区则雨水偏少,青枯病发病率也相对较低。就同一地点不同处理来看,施用功能性有机肥烟区的青枯病发病率和发病指数均低于对照。田间试验发病率与病情指数见表2。从统计分析结果看,不同处理间的青枯病防治效果差异不显著,p值均大于0.05。可能是因为同一处理不同小区之间的差异太大,本年度的有机肥用量又太小,因而导致田间试验的处理间差异不显著。但是,从田间烟株长势来看,施用生物有机肥对烟草青枯病的防治具有一定作用,发病率和病情指数都略低于对照。比较两地的试验结果,两地区的差异显著,方差分析t0.05为1.94,发病率t为2.60,病情指数t为2.79,数据表明安徽芜湖烟区的青枯病防治效果较福建邵武更为明显些。2006年试验结果见图4。从图中可以明显看出,施用生物有机肥处理的烟株发病率远远低于对照,发病率和病情指数分别较对照降低了30.69%～39.58%和21.85～25.74。并且施用生物有机肥的B、C、D处理的发病率和病情指数远低于2005年各处理,其中效果最好的是B处理。这主要是由于拮抗菌随有机肥施入土壤后,需要与土著微生物竞争营养而后在根际定殖,成为优势菌后才能控制病害的发生和流行;另一方面,在2005年烟株生长后期,降雨量较大,各处理烟株之间没有采取有效的隔离措施,有机肥施用量又比较小,而引起田间青枯病害相互间的传染、流行。连续两年的试验结果也表明,只有经过长期施用这种功能性有机肥,使拮抗菌在土壤中的数量逐渐增加并成为优势菌后,才可能彻底、有效地防治烟草青枯病害大面积发生。3生长抗菌菌为监测抑制烟草青枯病效果较好的拮抗菌T5在堆肥中的生长情况,以硫酸庆大霉素为诱变剂,通过浓度梯度平板法筛选出拮抗效果与T5菌株类似的抗性突变菌株T5-1,该菌遗传稳定性较好。以牛粪、玉米秸秆为原料生产有机肥,当堆温达到50℃以上后保温2周,然后降温至40℃时接入T5-1菌株,40℃下培养3d,可得到拮抗菌和嗜温菌浓度均为1012cfug-1(干基)的高密度堆肥产品。大田试验结果表明,该有机肥对烟草青枯病具有一定的防治效果,第一年有机肥施用量较小,效果不显著;第二年连续施用有机肥且加大施用量,抗病效果显著增加,其中生物有机肥作基肥施用效果最好,青枯病的发病率较对照降低了50.65%,病情指数降低了71.09%。4田间或田间生物有机肥不同用量对烟草青枯病的影响生产有机肥时,功能菌株的接入时间及温度控制是重要条件之一。本试验中堆肥过程的温度控制是通过适当翻堆搅拌来调节的,有人建议在堆肥生产中调节堆肥通气条件来控制堆肥温度也不失为一种简单可行的办法。有关功能菌的接入时间有人建议将拮抗微生物接种在堆肥的最终产品中而不是接种在堆肥过程中,但是这种方法可能由于堆肥中的土著微生物过多,与拮抗菌进行营养竞争而使得拮抗菌数量下降,所以本次研究采用在堆肥过程中接种,结果表明拮抗菌的生长繁殖状况较好,实现了快速、低成本生产高密度拮抗菌有机肥的目的。大田试验中影响因素较多,2005年田间试验抑制烟草青枯病效果不显著的原因可能有以下几个方面:(1)功能性有机肥中仅由1种拮抗菌配制而成,该青枯病是我国南方烟区发生比较严重的病害之一,对该病的抑制可能需要几种或更多的拮抗菌协同作用才能收到更好的抑制效果;(2)有机肥施用量为每株烟20g,施用量偏少,由此带入的拮抗菌和有机营养不足,而且以基肥形式施入后拮抗菌在与土著微生物的竞争中逐渐减弱,因而至青枯病发病时期已无法更好地起到拮抗作用;2006年加大施用量后以基肥的形式施入,对病菌的抑制效果明显增加;大田试验结果也证明2005年生物有机肥作追肥处理稍好,而2006年则以有机肥作基肥处理抑病效果较好;(3)通过调节土壤微生态平衡抑制土传病害的方式,本身就