烟草赤星病菌拮抗木霉的筛选及生防机制研究

烟草赤星病菌拮抗木霉的筛选及生防机制研究

这种共生因素是最希望的生防因素，可以取代各种化学品。近年来,已有不少文章陆续报道了该菌的某些种对多种土传病原真菌具有拮抗作用,且制成的菌剂在温室及田间应用取得成功的例子,因而木霉在植病生防中的应用潜力日益受到重视。烟草赤星病(Alternariaalternata)是目前我国各烟草种植区烤烟成熟期日益严重的主要病害,在我国各烟区普遍发生。为了探讨对该病的有效防治途经,本文报到了关于对该病菌具有拮抗作用的木霉菌的筛选及其生防机制的研究。1材料和方法1.1试验中的蘑菇7个烟草赤星病菌的菌株分别分离自云南省不同烤烟种植区的烟株病叶。1.2强制逮捕法1.2.1赤星病菌及其处理在装有15mLPDA的培养皿(9cm直径)中心接种赤星病菌的菌丝块(直径8mm),4周放置灭菌的尼龙网片数块(2cm×2cm),28℃培养3d后,网片上布满赤星病菌菌丝后待用。1.2.2土壤分离取供试土壤10个(分别采自白菜、蚕豆、豌豆、莲花白、莴苣、松侧柏的根际)。各土样分别盛于灭菌培养皿内,加适量无菌水润湿。1.2.3土壤表面每样品的测定取1.2.1布满菌丝的尼龙网片紧贴于已制备好的土壤表面,每皿3块,每土样2皿。培养皿放于25℃下,每天12h光照、5d后将尼龙网片移到马丁洋菜培养基上,每皿1块,每土样4皿。1.3木霉菌的培养、纯化将尼龙网片周围长出的菌落分别挑出置于PDA平板上培养、纯化,所获得的菌株依照Rifai和Bissett修订的木霉菌种群分类系统和标准进行鉴定。1.4不同病原菌的生长和木霉的抑制作用将7个分离自不同地区的烟草赤星病菌株和已鉴定的18个木霉菌株分别在PAD平板上(25℃)生长3d后,再对峙培养,即分别挑取新鲜培养的7种病菌菌丝(大小约4mm2)放在PAD平板一侧的中间,同时在相对一侧的中间放置同样大小的木霉菌丝块,两者相距1.5cm,每种病菌分别与18种木霉菌株配对,置于25℃恒温培养箱内培养,逐日观察菌落的生长和木霉的抑制作用,连续观察7～10d。1.5寄生虫现象观察将对峙培养3d后的木霉与病菌混合生长处的琼脂块分别置于光学显微镜下观察,及按常规方法制样后置于透射电镜下观察。2结果与分析2.1生长迅速,直径大,形态复杂,生长迅速,开展氧漂教育用诱捕法分离10个土样,木霉的出现频率为60.3%,共获得18个菌株;经鉴定所得菌株全部为绿色木霉,(TrichodermaviridePers.exS.F.Grey)(图1)。该菌生长迅速,速率为0.68mm/h。初期菌落平展,白色,菌丝稀疏,成熟的菌落暗绿色,背面无色。菌丝无色,具分隔,多分枝,直径1.5～2μm。梗分枝,成簇,主干和每个侧枝的顶端都着生瓶梗,瓶梗呈瓶状或擀面棒状,轮状或假轮状着生于分生孢子梗上,每轮3个,偶尔也有单生或对生。分生孢子圆球形或卵圆形,直径3.4～3.7μm。2.2木霉与赤星病菌的相互作用通过对峙培养从18株绿色木霉菌株中,筛选出1株对7个赤星病菌均具极强拮抗作用的菌株Tv-1。对峙培养中发现木霉菌菌丝生长旺盛可产生大量短绒状气生菌丝和分生孢子丛,越过菌落交界处直接在赤星病菌菌落上生长,逐渐将病菌消解(图2);光学显微镜下观察发现木霉与赤星病菌菌落交错处未接触木霉菌丝的病菌菌丝已发生原生质浓缩、液泡化、菌丝消解断裂的现象。这些结果表明:Tv-1菌株的拮抗作用表现不是产生抑菌圈,而是使病原菌菌丝生长明显受到抑制(图3)。2.3病原菌植物生长光学显微镜下观察结果表明,木霉菌菌丝附着、缠绕于赤星病菌菌丝上生长,病菌菌丝原生质浓缩、液泡化、萎陷而最终分解;透射电镜观察结果表明木霉所附着、缠绕的寄主菌丝体的壁被其指状吸器穿透,并通过该吸器吸取菌丝体内含物(图4,5)。3tv-1菌株的缺乏分离获得的Tv-1菌株对烟草赤星病菌具有极强的拮抗作用。其生防机制主要表现为重寄生、极强的生长竞争能力,但也发现有消解菌丝类物质的直接抗菌作用存在。一方面,Tv-1菌株对赤星病菌的拮抗作用不产生抑菌圈;另一方面,一些未与Tv-1菌株接触的病菌菌丝也会出现原生质浓缩、液泡化,菌丝消解断裂,这种现象国外文献报道认为与木霉菌产生的一些重要生理活性物质有关,如分泌水解酶、几丁质酶、β-1,3葡聚糖酶,还可分泌某些抗菌素等,本实验在菌剂生产过程中发现用Tv-1菌株单独接种木屑,该菌也能旺盛生长、产孢,因而Tv-1菌株可能产生纤维素酶利用纤维素,但在菌丝消解过程中,起作用的究竟是何种物质,其中详细机理尚