小鼠深静脉血栓模型的建立

小鼠深静脉血栓模型的建立

深静脉血栓形成（dvt）也称为深静脉血栓形成，是临床上常见的血管外科疾病。患病后易造成肢体病残,严重者可危及患者生命。近年来深静脉血栓形成的发病情况有逐年上升的趋势。建立合适的DVT模型是研究DVT发病机制和治疗方法的基本前提,小鼠是生命科学研究中使用最多的模型动物,本研究拟建立稳定的小鼠深静脉血栓形成模型,为应用转基因小鼠研究深静脉血栓的发病机制提供模型参考。1材料和方法1.1实验动物及动物C57BL/6J小鼠,雄性,6～8周龄,体质量20～25g,SPF级,购于广东省实验动物中心,生产许可证号SCXK(粤)2008-0002。15只小鼠适应性喂养1周后,随机分为深静脉血栓组10只和假手术组5只。1.2观察显微和体视显微组织包埋机、石蜡切片机(德国莱卡);倒置光学显微镜(日本奥林巴斯);体视显微镜(重庆奥特);1%(φ)戊巴比妥钠、1%(φ)氨苄溶液等。1.3下腔静脉损害大鼠的正常饲养腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.1mL/20g)麻醉小鼠后,固定(图1A)并腹部消毒后沿其腹白线逐层打开腹腔,切口不能太大,下至凝固腺,上至露出肝脏一角即可(图1B)。将腹腔内小肠等器官拖出放置于小鼠左侧,暴露出下腔静脉,动作要轻柔,避免损伤器官,拖出的器官用浸润过生理盐水的纱布包裹(图1C),防止长期置于空气中造成脱水。移至体视显微镜下,钝性分离血管周围结缔组织(图1D),暴露下腔静脉及其分支,在肾静脉下方将腹主动脉和下腔静脉剥离开(图1E),然后用7/0缝合线将下腔静脉结扎(图1G),之后逐个将其分支(图1F)结扎。按解剖位置将肠道等器官放回腹腔,在腹腔中加入1%氨苄溶液0.2mL,防止感染。用5/0缝合线逐层缝合腹腔,术后置于25～28℃的环境中,直至小鼠复苏,即可正常饲养。假手术组除不结扎下腔静脉及其分支外,其他操作同造模组。1.4下腔静脉血管术后48h脱臼处死小鼠剖开腹部,移开小肠等器官,暴露下腔静脉,置于体视显微镜下。在下腔静脉主脉管的结扎处下方,取出结扎线下方1.0cm长下腔静脉段血管(图1H),生理盐水漂洗,投入4%(φ)中性甲醛溶液中4℃固定过夜。脱水后石蜡包埋、切片,进行HE染色,在100倍光镜下观察并拍片。2结果2.1动物支血形成模型15只小鼠均存活,未出现静脉血管损伤破裂出血等严重并发症,以及呼吸困难、气促、呛咳、休克等肺动脉栓塞症状,精神尚可,活动自如。10只小鼠均成功建立深静脉血栓模型,5只假手术组小鼠均没有血栓形成。下腔静脉肉眼下见血栓充满静脉管腔,呈紫红色,血栓长度5～7mm,质量15～20mg(图1H、I)。2.2静脉和静脉置管网管光镜下可见静脉内血栓为混合血栓,且与血管壁无粘连;血栓主要为均匀分布的红细胞,其间可见纤维素网状结构及散在血小板及白细胞;血管内皮细胞不连续,静脉周围炎性细胞增多,血栓尚未开始机化。假手术组下腔静脉血管内膜表面光滑、平整,未见血栓形成(图2)。3dvt的并发症深静脉血栓,尤其是下肢的深静脉血栓形成作为住院病人的一项严重疾病及常见并发症已越来越受到重视,具有很高的致残率及致死率。国外文献报道,深静脉血栓是继急性冠脉综合征和中风后的第三大心血管疾病。据报道,全世界每年深静脉血栓发病率约为0.1%,美国每年患病人数约为200万,其中发生肺栓塞者60万,死亡人数约6万。英国患下肢深静脉功能不全者占人口的0.5%,其中大部分是下肢深静脉血栓形成的后遗症。在普通外科手术中约29%的恶性肿瘤病人并发深静脉血栓,其中多发生于下肢。国内有报道显示,术后下肢发生率约为27.8%,且有逐年增多的趋势。Virchow曾提出血栓形成三大因素:血流滞缓、血液的高凝状态和血管壁的损伤(血管内皮细胞的损伤),一直得到普遍的认可,成为DVT的病因总则。目前关于DVT形成的危险因素也不断补充和完善,如年龄、肥胖、静脉曲张、吸烟、髂动脉压迫综合征等。这些危险因素可相互叠加、相互影响,最终导致血流滞缓,血管内皮缺氧、受损,血液高凝,从而促使DVT的发生。近年来,血管内皮细胞的损伤、血小板黏附、聚集、释放和血浆中可溶性凝血因子的激活是血栓形成的新三要素。目前用于静脉结扎建造深静脉血栓模型的动物多为大鼠、兔、犬、小型猪等,这些动物模型均可以形成稳定的血栓用于抗血栓/溶栓等的药理研究,但由于这些动物都比较少用于构建基因工程动物,不便用于研究血栓发病机制的研究。然而,小鼠繁殖能力强且繁殖周期短,易进行基因操作,是生命科学研究中使用最多的模型动物。因此建立小鼠深静脉血栓模型更加有益于通过基因工程动物例如基因敲除、基因突变、基因过表达等来研究深静脉血栓形成的确切发病机制及制定有效的防治方案。本实验通过结扎小鼠下腔静脉及其分支导致静脉血液回流障碍,局部血流淤滞、缺氧,血管内皮细胞损伤,启动凝血过程,血小板与局部产生的凝血因子因血流受阻停留在局部致血栓形成。造模48h实验组病理结果示管腔内血栓充盈,血管内皮细胞不连续,炎性细胞浸润血管并大量聚集在血管周围,血栓与管腔无明显粘连,这与文献