环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制可行性研究报告

更多下载尽在我的主页更多下载尽在我的主页专业打造专业打造环介导等温扩增快速检测病原菌型试剂盒研制可行性争论报告李思光一、选题的必要性1、工程所处技术领域产业政策本工程属生物高技术领域，是国家重点支持的争论领域，工程主要针对严峻影响人类安康的主要病原菌的检测与诊断需要进展检权的科研成果。本工程技术含量高，市场竞争力强，工程完成后能够产生较好的经济效益和社会效益，工程符合国家产业、技术政策。2、工程所处技术领域技术进呈现状目前的病原菌检测方法费时、费力、准确性低，开发快速、准确题。本工程针对病原菌检测中存在的问题，承受高灵敏度、高特异性的环介导等温扩增技术开发出简便、快速、经济的检测试剂。3、工程技术先进性，对相关领域技术进步的推动作用环介导等温扩增是利用4个特别设计的引物和具有链置换活性DNADNA1h109LAMP推动作用。4、工程目前进展状况课题组开展了大量前期争论工作，已完成了本工程所需的科研了根底。二、技术方案论述〔一〕工程技术关键点和创点，工程完成时到达的技术水平1、技术关键〔1R6局部病原菌的基因组DNA，并依据基因组特点承受等温扩增软件设计了局部引物，现正通过试验确定这些引物的性能。〔2〕本工程的另一技术关键是最正确等温扩增体系优化。通过对引物浓度、内引物和外引物的最正确浓度比、模板浓度、dNTPBstDNA聚合酶用量、Mg2+浓度等条件进展优化，能够获得最正确试验条件。2、创点〔1〕既往对病原菌的检测一般承受细菌分别培育鉴定法，但该方法的准确率低，所需时间长，往往延误临床正确的诊断和治疗。近PCRPCRPCR方增法具有快速、准确、灵敏的特点。而且，等温扩增法是在恒温下进展，只需一个简洁的恒温装置，不需要PCR试验中的昂贵仪器，因而易于在基层食品质量检测部门和医院推广使用。〔2〕目前，国外已有将环介导等温扩增技术应用于病毒DNARNA等温扩增技术，以抑制当前一个等温扩增反响只能检测一种DNA或RNA的缺点。因此，本工程的实施，将开发出具有自主学问产权的病原菌检测试剂盒。3、工程完成时到达的技术水平工程完成时，开发的多重环介导等温扩增快速检测病原菌技术及其配套试剂盒到达国际先进水平。〔二〕工程技术方案1、技术方案环介导等温扩增〔LAMP〕和多重等温扩增快速检测常见病原菌方法的建立①常见病原菌特异性LAMP引物的设计。依据GenBank数据DNALAMP专用引物设计软件设计特异性LAMP引物〔包括每类致病菌的两个外引物、两个内引物和的序列，以保证靶序列的特异性扩增〕DNADNADNA。③LAMP扩增反响体系的优化：对引物浓度、内引物和外引物dNTPBstDNAMg2+浓度等条件进展优化。55-65℃之间优化等温扩增温度。⑤扩增产物的检测：建立快速显色法和电泳分析法两种检测扩增产物的方法。⑥以上述争论结果为根底，建立常见病原菌的环介导等温扩增和多重环介导等温扩增快速检测技术。常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法的灵敏度分析将常见病原菌目标基因克隆至pMD-18T载体，转化后提取质105、104、103、102、101，以其为模板做环介导等温扩增反响，检测本方法的灵敏度。常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法的特异性分析分别以病原菌和非病原菌基因组DNA为模板做环介导等温扩增反响，检测本方法的特异性。常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法与国际标准PCR以LAMPPCR扩增，并与LAMP的扩增结果进展比较分析，进一步推断LAMP技术的灵敏度、特异性和稳定性。常见病原菌的环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测方法在食品检测和临床诊断中的应用争论将本方法应用于食品检测和临床诊断中，分析本方法对不同样品检测的准确率。病原菌的环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测试剂盒的研制依据本工程所建立的LAMPLAMP〔包括单一病原菌检测试剂盒和多种病原菌同时检测试剂盒。2、工艺流程样品收集样品收集基因序列分析核酸提取引物设计引物优化、组合LAMP反响体系的建立反响条件优化特异性试验灵敏度试验阳性比照阴性比照LAMP方法应用于病原体检测国标法比较试验同类产品比较试验试剂盒中试〔三〕工程技术质量指标95%。本工程建立的方法对病原菌目的基因检测的灵敏度到达101本工程建立的方法不产生非特异性扩增产物。30-60560钟内完成。〔四〕工程执行过程中各阶段目标2007第一季度：设计引物，引物合成，购置试验菌株和有关试剂，完善试验条件。DNA第三季度：等温扩增反响体系优化，温育条件优化。第四季度：扩增反响产物检测方法的建立〔快速显色法、电泳分析法。2008第一季度：环介导等温扩增快速检测病原菌方法操作程序确定，多重等温扩增同时检测多种病原菌试验技术建立。其次季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方法的准确度分析。第三季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方法的灵敏度分析。第四季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方PCR2009第一季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方法在食品和临床标本上的应用及效果分析。其次季度：环介导等温扩增快速检测病原菌试剂盒和多重等温扩增试剂盒研制。第三季度：试剂盒的应用及技术推广。第四季度：课题总结，鉴定。〔五〕工程经费预算状况本工程申请科研经费5万元。其中设备、仪器购置费1万元；0.50.50.520.5三、工程实施支撑条件1、工程技术来源本工程的技术由工程申请人建立。2、工程试验、检测条件工程申请人所在学院—生命科学学院拥有食品科学国家重点建试验室。这些重点学科和重点试验室设施完善、先进，具有进展本工程争论的试验条件和试验场地，为本工程的完成供给了保障。工程申请人所在的江西省生物化学与分子生物学重点试验室实验条件先进，具有PE-9700型PCR仪，全自动DNA测序仪〔ABIPrism3100、高速冷冻离心机、超速冷冻离心机、超低温冰箱、Milli-Q超纯水系统、各种规格的电泳仪、紫外分光光度计、设施先工作。工程申请人长期从事分子生物学争论工作，娴熟把握了分子生的顺当完成奠定了技术根底。3、工程申请单位人才资源状况“211”工程重点建设大学，人才资源丰富，科研力气雄厚。生命科学学院有专任15060282:1。4、工程组人员专业构造、职称构造工程组科研人员7人，主要由生物化学与分子生物学专业、微22325、工程增投资筹集状况5四、工程预期经济效益1、预期市场需求病原菌的检测是食品检测和临床诊断中的常规工程，食品检测检测工作中有很大潜力。然而，目前国外仅有将其用于病毒DNA和RNA检测的争论报道，在病原菌检测领域尚无以此技术开发的商业试剂，国内也未见这方面的争论开发报道。因此，开发病原菌的环介导的等温扩增试剂具有宽阔的前景。2、预期盈利水平508元，假设以201250万个样品的试剂，每年获利600产生明显的经济效益。3、预期产业化前景本工程是针对严峻影响人类安康的病原菌的检测问题提出的，子生物学技术，产品的科技含量高，生产本钱低，利润空间大。本的试剂生产企业经技术培训后可生产本产品。4、工程实施风险分析课题组已开展了本工程的前期争论工作，目前正在进展嗜水单科研平台建设工作。因此，本工程的实施根本上不存在技术风险。常规检测病原菌的细菌培育分别鉴定法费时费力，近年进展起来的PCR鉴定法易产生非特异性产物，导致假阳性或假阴性结果。PCR准确、灵敏、低本钱等优点。在本工程的争论中，我们还将建立一次全能够取代目前使用的常规分析方法和PCR方法，成为病原菌检测五、工程估量社会效益、环境效益1、