基因工程载体(质粒-3章)

基因工程载体概述基因工程是利用酶学方法将不同来源的DNA或cDNA，在体外切割、修饰、连接插入到不同目的的基因工程载体中，进行扩增和表达，研究基因结构和功能，基因和蛋白质关系的一种分子生物学技术。载体基因工程的十分重要的工具。载体DNA分子中是有一段生长扩增的非必需区，该区经人工改造后可插入外源的DNA，并可送入宿主细胞中，使外源DNA与载体DNA重组并共同扩增。目前的载体主要有：

1,质粒（Plasmid）载体

2,入噬菌体

3,柯斯质粒（Cosmid）

4,M13噬菌体

5,杂交质粒

6,病毒载体，包括穿梭载体（Shuttle）。

7,细菌人工染色体.(bacterialartificialchromosome，Shizuya，1992BAC)

8,酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，Merry，1983YAC)

9,来源于P1的细菌人工染色体（P1-derivedartificialchromosomePAC,loannon，1994）、

10,哺乳动物人工染色体（MAC，mamalartificialchromosome，Farr，1991）

11,人类人工染色体（HAC，humanartificialchromosome，Harrington,1997）

12,植物人工染色体(PAC)

质粒载体（Plasmid）

一词最早是由Lederberg，1952年提出的。是双链、闭环DNA复制子（replicon）,存在于细菌的细胞质中并独立于染色体之外,能自主复制的一类DNA。酵母的杀伤质粒（KillerPlasmid）是例外,它是一种RNA复制子。根据导链霉菌中存在线状质粒

。质粒是细菌复制所非必须的，也就是说细菌失去质粒后仍可正常生长繁殖。但质粒可以赋于寄主某种新的有利的表型。

质粒载体

质粒DNA的一般特点：

①质粒DNA可在宿主菌中自主复制，又是细菌复制非必须的。

②占总的基因组的1～3%。

③所有原核生物都有质粒。

④赋于细菌一种表型，是菌株特性不是菌种特性。

⑤隐蔽质粒(Crypticplasmid)。⑥质粒都是双链闭环DNA复制子，酵母的杀伤质粒例外(RNA)。质粒的一般生物学性质1969年Rownd提出严紧型复制控制的质粒和松驰型控制的质粒。主要指在标准的培养基生长条件下，每个细菌中所含的质粒DNA的拷贝数多少划分的。严紧型质粒，一般分子量较高；每个寄主细胞中仅含10~60个拷贝的质粒；松驰型质粒,每个细菌中所含的质粒DNA的拷贝数高,一种质粒究竟属于严紧型还是松驰型并不是绝对的。往往与寄主状况有关。质粒的复制不仅受自身的制约，而且还受寄主菌的控制。氯霉素是蛋白质合成的抑制剂，一般在细菌生长的对数生长期后期(细菌达1×109细胞/mL)，加入氯霉素或壮观霉素，细菌染色体和严紧型质粒复制停止，而松驰型质粒经过10~12小时，每个细胞中可多达几百个，甚至几千个质粒。每个细胞中可达50%以上DNA是质粒DNA。严紧型(Stringentplasmid)和松驰型(relaxedplasmid)质粒PUC质粒都属松驰型质粒。PACYC184等质粒属严紧型质粒。根据需要使用严紧型还是松驰型质粒,如果插入外源DNA较大,或其产量过高会产生对宿主菌新陈代谢有干扰作用时，常选用严紧型质粒。反之选用松驰型质粒。2.质粒的不相容性(incompatibility)

利用同一复制系统不同质粒不能稳定的和平共处的生存，称为质粒的不相容性，有时又称不亲和性，是指在没有选择压力情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定地共存现象。在细菌增殖过程中，其中一种质粒必然会丢失。分子克隆技术正基于质粒的不相容性质，在只带有一种质粒的细菌中，提取单一的DNA。3.质粒的转移性革兰氏阴性细菌的质粒分为接合型质粒(Conjugativeplasmid)，又叫自我转移质粒。它们既具有自我复制遗传信息，又具有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。接合型质粒多属于严紧型质粒。非接合型质粒(non-conjugativeplasmid)也叫不能自我转移的质粒。因为它们仅仅带有自主复制的遗传信息。非接合型质粒多属于松驰型质粒。1）质粒的类型非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁移作用（mobiligation）又叫质粒的诱动。

带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的R质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁移作用(mobilization)又叫质粒的诱动。ColE1是一种可以迁移但属于非接合型质粒。2）F因子

F因子是最有代表性的接合型质粒，又称致育因子(fertilityfactor)或性质粒(Sexplasmid)。它在寄主细胞中有三种存在方式：①独立于染色体之外，闭环双链DNA形式存在。这种细胞称F+细胞。②独立于染色体之外，闭环双链DNA形式存在，但其DNA上还携带有寄主菌染色体基因或DNA区段。这种细胞称之为F-细胞。③以线性DNA形式，从不同位点整合到寄主菌染色体上，这种细胞称为Hfr细胞(高频重组细胞)。F因子是雄性决定因子，F+细胞表面可以形成一种叫做性须（pilus）的结果，它促使F+经性须进入F-细胞。F-细胞则变为F+细胞。F因子可以通过接合作用自我转移，也能够带动寄主染色体一道转移。但F因子的这种整合过程是可逆的。在一定条件下，Hfr细胞又可重新变为F+或F-细胞。基因工程多选用非接合型质粒，主要安全角度考虑

人工质粒要素1．质粒的基因组小好（不影响生物学功能前题）。转化入细菌的转化率与质粒大小呈反比，当质粒大于15kb时，转化率将成为限制因素,质粒大，拷贝数越低。2．质粒应易于转化。3．质粒应有较多的拷贝数。4．选择标记。5．质粒DNA可插入结合较大的外源DNA。

大肠杆菌质粒分子的结构示意图环形染色体DNA环形质粒分子大肠杆菌细胞抗菌素抗性基因控制质粒DNA转移的基因质粒DNA质粒主要包括几个组成部分复制子（reilcator）复制起始位点(replicationoriginsite)多克隆位点（Polylink）(MCS)辅助序列(COS位点等)选择标记(LacZ,抗性等)pUC18和pUC19质粒图谱质粒主要包括几个组成部分：一、复制子（reilcator）也就是基础复制子（basicreplicon），具有原质粒同样拷贝数的最小自主复制单位。一般约2kb，含一个复制起始部位Orgin（Ori）拷贝数多少和携带有控制复制的基因信息。

复制起始位点(replicationoriginsite)

是富含A,T区,双链DNA在此解鏈出现复制叉.紧靠 富A,T区的侧面富G,C区,组成回文结构,是参与复制相关因子识别和结合位点.具备有多克隆位点（Polylink）(MCS)有数种限制性内切酶单一识别位点。便于插入外源DNA片段，易组建重组质粒而不影响质粒复制功能

有多用途的辅助序列如加入不同启动子序列，用于生产单链DNA或RNA，外源基因的大量表达。又加入COS位点，使载体能容纳更大的DNA片段等等。

质粒载体的选择标记：外源DNA片段与质粒载体DNA连接，再转化入宿主菌，经培养后需筛选鉴定转化子。这就需要利用质粒载体的可选择标记。

质粒载体的选择标记

最常用，主要有：四环素(Tet)、氨苄青霉素(Amp)、氯霉素(Cm)、卡那霉素(Kan)、新霉素(Neo)等。如质粒对氨苄青霉素有抗生时，则写成Ampr，反之则写成Amps。带有抗药性质粒称为R质粒。一个质粒载体通常有二种抗生素抗性基因，这样筛选质粒载体更可靠。外源DNA片段插入钝化了一个抗性基因，保留了另一个抗性基因。插入失活型载体，就是将外源DNA片段插入到会导致选择性基因(Ampr，Tetr等)失活的位点。如PACYC184质粒的EcoRI上插入外源DNA片段，会导致氯霉素抗生基因失活(Cms)。也有例外，如Villa-Komaroff等1978年发现鼠胰岛素cDNA片段插入PstI切点，并未使Ampr基因失活。抗生素抗性基因选择标记常用的是抗生素抗性基因的选择标记。主要有：四环素（Ter），氨苄青霉素（Amp），氯霉素（Cm），卡那霉素（Km）。新霉素（Neo）等。如质粒对氨苄青霉素有抗生时，则写成AmPr，反之则写成AmPs，。带有抗药性质粒称为R质粒。一个质粒载体通常有二种抗生素抗性基因

新的质粒还带有下列标记基因，使于筛选重组体：①HA②Luaferase③GFP④便于检测的多肽原理是具有四环素抗性的细菌对亲脂的螯合剂萎蔫酸(fusaricacid)极为敏感，因此，将外源性DNA插入到质粒载体的四环素抗性基因的酶切位点上，在含有萎蔫酸的培养基上筛选对四环素敏感的重组子，则是十分方便的方法。丢失四环素抗性标记的正选择体系四环素抗菌机理是抑制细菌蛋白质合成，使细菌停止生长，但菌不死亡。环丝氨酸是氨基酸的类似物，在细菌的生长过程中，如加入环丝氨酸，则会参入到细菌