从细胞因子及能量代谢角度研究慢性心力衰竭治疗的新课件

心血管药理讲座从细胞因子及能量代谢角度研究慢性心力衰竭治疗的新靶点及干预策略心血管药理讲座从细胞因子及能量代谢角度研究慢性心力衰竭治疗1主要介绍内容一、研究慢性心衰治疗新策略的必要性二、改善心肌能量代谢-治疗心衰的关键三、新策略及靶点：细胞因子、能量代谢与心力衰竭四、TNF-α及其受体—心衰的治疗靶点及希望？五、抑制TNF-α与TNF-R1的结合活性的合成的优选多肽Pep3治疗心衰效果评价六、进一步研究思路2主要介绍内容一、研究慢性心衰治疗新策略的必要性22精品资料精品资料3你怎么称呼老师？如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？教师的教鞭“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘……”“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”从细胞因子及能量代谢角度研究慢性心力衰竭治疗的新课件4世界卫生组织08年10月发布了全球疾病状况的最新评估报告，心血管疾病是当前导致人类死亡的最主要原因。一、研究慢性心衰治疗新策略的必要性心血管疾病肿瘤传染病(29%)心血管疾病的主要死亡原因—心力衰竭发病率高：国内患病率0.8%～0.9%，患者约1200万,而且每年呈现50万递增的趋势；预后差：每年死亡>20万，五年死亡率>50％；费用大：在欧美，治疗费用占整个卫生支出的2%，是肿瘤的2倍。世界卫生组织08年10月发布了全球疾病状况一、研究慢性心衰治5死亡代偿期失代偿期恶化期结构和功能的改变---重塑高血压，冠心病遗传，心肌病瓣膜病，先心病****心力衰竭心力衰竭的诱因和病理过程6死亡代偿期失代偿期恶化期结构和功能的改变---重塑高血压，冠6分子机制跨膜信号传递胞外刺激基因表达活化细胞形态、功能改变血流动力学因素神经-体液因素CARDIACHYPERTROPHY:TheGood,theBad,andtheUgly.AnnuRevPhysiol,2003.分子机制跨膜信号传递胞外刺激基因表达活化细胞形态、功能改变7激素、药物、神经递质膜受体第二信使

Ca2+离子通道活性肽心力

衰竭心律失常线粒体活性氧心脏病相关基因活性肽(1)(1)心力衰竭心力衰竭可能的发展基础8激素、药物、膜受体第二信使离子通道活性肽心力

衰竭心律失常线8FirstStepRef:Webster,MD,PhD:Acne.Dermatol1996,8:237-268慢性心衰治疗理念的进步70年代：改善血流动力学紊乱：强心、利尿、扩血管SecondStep90年代：抑制神经体液因子：β阻滞剂、ACEI/ARB

ThirdStep21世纪：心肌代谢疗法可望成为CHF治疗的新靶点。FirstStepRef:Webster,MD,PhD:9任何减少能量消耗的心力衰竭疗法，如β受体阻滞剂，ACEI，ARB均可以改善心衰患者的预后。增加能量消耗的药物，如正性肌力药物，则增加心衰的死亡率。“衰竭的心脏是一台缺乏燃料的发动机”能量缺乏可能是心衰的重要发病机制NeubauerS.NEnglJMed,2007,356:1140-1151.二、改善心肌能量代谢-治疗心衰的关键调节心肌能量代谢有望成为治疗心衰的新策略任何减少能量消耗的心力衰竭疗法，如β受体阻滞剂，ACEI，A10

心脏耗能位居所有器官之首，每天消耗6kgATP，搏动约10万次，向全身泵出10吨血液。心脏通过能量代谢将储存于脂肪酸或葡萄糖中的化学能转化为机械能，为心脏收缩和舒张提供能量。若能量产生和利用的效率发生改变，心脏便会出现功能障碍。心脏的能量代谢心脏耗能位居所有器官之首，每天消耗6kgATP，搏112、糖酵解（极少）1、线粒体氧化代谢脂肪酸（60%-90%）葡萄糖（10%-40%）正常心肌的能量代谢ATP来源2、糖酵解（极少）1、线粒体氧化代谢脂肪酸（60%-12正常心肌的能量代谢底物代谢氧化磷酸化能量利用正常心肌的能量代谢底物代谢氧化磷酸化能量利用13正常心肌的能量代谢过程（一）：底物的利用丙酮酸葡萄糖脂肪酸糖酵解脂酰CoA合成酶乙酰CoA丙酮酸脱氢酶（PDH）有氧状态脂酰CoA脂酰CoAβ-氧化三羧酸循环CO2+NADHMitochondriacytoplasmBlood肉毒脂酰转移酶（CPT）正常心肌的能量代谢过程（一）：底物的利用丙酮酸葡萄糖脂肪酸糖14正常心肌的能量代谢过程（二）：氧化磷酸化线粒体内膜ⅠⅡⅢⅣQH+H+H+O2H2OH+ⅤATP合酶ADP+PiATPNADH＋HNAD＋FADH2FAD三羧酸循环游离脂肪酸β氧化Mitochondria正常心肌的能量代谢过程（二）：氧化磷酸化线粒体内膜ⅠⅡⅢⅣQ15主要表现：2004年，VanBilsen等提出心肌代谢重构的概念。

VanBilsenM,etal.CardiovascRes,2004,61:218-226心肌代谢重构（metabolicremodeling）

由心肌细胞糖类和脂肪等物质代谢紊乱引起心脏能量代谢途径改变，导致细胞结构和功能异常的现象。主要表现：2004年，VanBilsen等提出心肌代谢重16脂肪酸氧化作用受损，主要的心肌能量来源从脂肪酸β氧化变为糖酵解。重构过程至失代偿状态，心肌能量缺乏。RazeghiP,etal.Circulation,2001,102:2923-2931.PaolissoG,etal.Metabolism,1994,43:174–179.1心肌底物利用变化衰竭心肌的能量代谢FFA氧化率正常或增加，葡萄糖摄取和糖酵解可能加速，心肌细胞处于代偿状态。

心衰早期

心衰晚期

脂肪酸氧化作用受损，主要的心肌能量来源从脂肪酸β氧化变为糖酵17脂肪酸氧化受损可能继发于线粒体结构紊乱。PDH和CPT-1活性改变脂肪酸氧化的基因表达下调BilsenMV.CardiovasularRes.2009,81:420-428衰竭心肌的能量代谢1心肌底物利用变化脂肪酸氧化受损可能继发于线粒体结构紊乱。BilsenMV.18ATP产生减少，心肌收缩、舒张功能障碍2

氧化磷酸化受损线粒体结构、数量改变电子传递链活性降低ATP合酶效能降低解偶联蛋白表达增强IdeT,etal.CircRes,2001,88:529-35.QuigleyAF,etal.JCardFail,2000,6:47-55.CasademontJ,etal.HeartFailRev,2002;7:131-9.衰竭心肌的能量代谢ATP产生减少，心肌收缩、舒张功能障碍2氧化磷酸化受损193ATP转移和利用受损线粒体内膜ANT蛋白表达下降cytoplasmATPADP+线粒体肌酸激酶+肌酸（Cr）

磷酸肌酸（PCr）衰竭心肌的能量代谢3ATP转移和利用受损线粒体内膜ANT蛋白表达下20PPARα调节心肌线粒体功能及脂肪酸氧化的重要核转录因子。PPARα基因敲除鼠心肌脂肪酸氧化明显降低，而转基因鼠心肌脂肪酸氧化增强。研究发现，心衰患者心肌组织PPARα的表达较正常心肌组织下降54％，PPARα受损可能导致心肌能量匮乏。KarbowskaJ,etal.CellMolBiolLett,2003,8:49-53衰竭心肌能量代谢的基因调节重要的核受体转录因子--PPARα

PPARα调节心肌线粒体功能及脂肪酸氧化的重要核转录因子。K21外源性配体（调脂药）内源性配体（长链脂肪酸）PPARαPPRE脂肪酸氧化（FAO）基因CD36/FATFABPFACSmCPT-1MCAD,LCADUCP3细胞核PPARα衰竭心肌能量代谢的基因调节StanleyWC.PhysiolRev.2005,85:1093-1129外源性配体（调脂药）内源性配体PPARαPPRE脂肪酸氧22重要的核转录共活化因子—PGC-1α衰竭心肌能量代谢的基因调节可与PPARα等多种核转录因子结合PGC-1α生物学效应脂肪酸氧化增强葡萄糖氧化减弱线粒体生物合成增加重要的核转录共活化因子—PGC-1α衰竭心肌能量代谢的基23ZhouSG,LiuPQ*（刘培庆，通讯作者）.ProteomicAnalysisofHypertension-InducedLeftVentricularHypertrophybyTwo-DimensionalDifferenceGelElectrophoresisandMassSpectrometry"JProteomeRes,2006,5(11):2901-2908(IF6.92)24①SHR与2k2cRHR心肌肥大大鼠心肌组织蛋白组学研究发现了18个差异表达蛋白，其中12个是能量代谢密切的酶，如α-烯醇化酶、短链脂酰辅酶A脱氢酶、NADH脱氢酶α亚复合体10、谷胱甘肽-s-转移酶等研究基础ZhouSG,LiuPQ*（刘培庆，通讯作者）.Pro24研究了NAD合成的限速酶在心肌肥大中点变化及调控机制Nmnat2protectscardiomyocytesfromhypertrophyviaactivationofSIRT6.Nmnat3protectscardiomyocytesfromhypertrophyviaactivationofSIRT3.研究了NAD合成的限速酶在心肌肥大中点变化及调控机制25NAD+的生物合成尼克酰胺磷酸核糖基转移酶（Nampt）和烟酰胺单核苷酸腺苷酰基转移酶（Nmnat）对NAD+的合成起到了关键的催化作用。NAD+的生物合成尼克酰胺磷酸核糖基转移酶（Nampt）和26NAD+的转运及细胞分布NAD+的转运及细胞分布27从细胞因子及能量代谢角度研究慢性心力衰竭治疗的新课件28③证明了PPARα、NFATc4及GATA-4之间相互作用在心肌肥大中的意义。29③证明了PPARα、NFATc4及GATA-4之间相互作用29②心衰过程中转录调控因子PGC-1α、RIP140表达与能量代谢关键指标的关系30②心衰过程中转录调控因子PGC-1α、RIP140表达30增加线粒体生物合成NRF(核呼吸因子)PGC-1α--PPAR线粒体生物合成。此二者是调控心肌脂肪酸分解和线粒体供能的枢纽心肌代谢疗法—底物的调节增加线粒体生物合成NRF(核呼吸因子)线粒体生物合成。此31心肌代谢的争议与思考脂肪酸葡萄糖心肌肥厚和心衰时，能量代谢底物改变何种程度是代偿性的，何种程度是失代偿性的？脂肪酸氧化抑制在何时？抑制到什么程度?可以改善心衰。心衰时葡萄糖代谢可以代偿脂肪酸氧化降低的能量不足吗？心衰心肌代谢心衰心肌代谢的争议与思考脂肪酸葡萄糖心肌肥厚和心衰时，能量代32代谢重构在心衰治疗中的意义

拮抗神经体液：血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、β-受体阻滞剂心衰缺能－底物的调节：

1）增加葡萄糖氧化：曲美他嗪（Trimetazidine,TMZ)

2）抑制脂肪酸氧化：L-卡尼丁(L-carnitine)3）增强呼吸链功能：辅酶Q10

4）补充磷酸肌酸

5）Potentialtherapy:promotemitochondriabiogenesis代谢重构在心衰治疗中的意义拮抗神经体液：血管紧张素转换酶33三.新策略及靶点

细胞因子受体、能量代谢调控？心衰过程中增高的细胞因子、神经激素及生长因子形成网络，其错综复杂的网络调节紊乱决定了心衰病理过程的复杂性，针对某一靶点或单一环节的药物往往难以起到理想的治疗心衰效果。靶向细胞因子受体及心肌能量代谢关键环节的药物具有重要的研发前景，心衰新靶点的干预正在成为治疗心衰的希望。34ArdehaliH,etal..EurJHeartFail.2012;14(2):120-9.三.新策略及靶点

细胞因子受体、能量代谢调控？心衰过程中增高34经典的神经-体液因素

肾素—血管紧张素—醛固酮系统交感神经系统内皮素系统

胰岛素抵抗细胞因子和生长因子经典的神经-体液因素35

血管平滑肌细胞成纤维细胞血管内皮细胞心肌细胞免疫细胞肥大凋亡舒缩增殖胶原的合成和分泌合成细胞因子调控心肌细胞血管生成炎症反应调节心脏微循环炎症反应血管平滑成纤维细胞血管内皮免疫细胞肥大增殖血管生成炎症反应36细胞因子网络与炎症反应通路引自:SunSC.ThenoncanonicalNF-κBpathway.ImmunolRev.2012,246(1):125-4037细胞因子网络与炎症反应通路引自:SunSC.Theno37TNF-α及其受体—炎症性疾病重要治疗靶点！TNF-α是诸多炎性相关疾病细胞因子网络的关键部分，也是与能量代谢障碍密切相关的细胞因子，TNF-α主要通过TNFR1介导胞内信息传递及细胞功能改变，是炎症性疾病重要治疗靶点。38ChenG,GoeddelDV.TNF-R1signaling:abeautifulpathway.Science.2002，296:1634TNF-α及其受体—炎症性疾病重要治疗靶点！TNF-α是诸多38

以TNF-α孵育AC16（人源性心肌细胞株）或H9c2细胞（心肌细胞株），可以明显下调丙酮酸脱氢酶激酶4、PGC-1α、肉碱脂酰基转移酶Ⅰ(CPT-Ⅰ)，诱导葡萄糖氧化率显着增加，同时增加MCP-1及IL-6表达增加，该作用主要通过NFκB及P38信号通路。心脏特异性过表达TNF-α小鼠(Musmusculus)也表现出明显的PGC-1α表达下调。GaoF,etal.JCardiovascPharmacol.2012;59(6):500-6PalomerXetal.CardiovascRes2009;81:703-712四、TNF-α及其受体—心衰的治疗靶点及希望？（一）TNF-α与心肌能量代谢

以TNF-α孵育AC16（人源性心肌细胞株）39SchematicrepresentationofthemechanismsinvolvedinthemetabolicdysregulationofAC16cellstreatedwithtumournecrosisfactor-α.PalomerXetal.CardiovascRes2009;81:703-712PublishedonbehalfoftheEuropeanSocietyofCardiology.Allrightsreserved.©TheAuthor2008.Forpermissionspleaseemail:journals.permissions@Schematicrepresentationofth40（二）TNF-α及其受体—心衰的治疗靶点及希望？普遍支持慢性心衰患者循环血中TNF-α水平显著增高，且增高的程度与CHF的严重程度、心功能分级及死亡率呈正相关。不同病因间（高血压、冠心病、风湿性心脏病、扩张型心肌病）所导致的心力衰竭循环中TNF-α的含量无明显统计学差异，提示循环血中TNF-α增高参与心衰的基本病理过程。LevineB,etal.NEnglJMed.1990;323(4):236-41.KosarF,etal.EurJHeartFail.2006;8(3):270-4.SharmaR,etal.AmJCardiol.2003;15;92(2):188-93.411、临床研究资料（二）TNF-α及其受体—心衰的治疗靶点及希望？普遍支持慢性412.实验动物水平研究1.

转TNF-α基因小鼠出现心衰表现，提示TNF-α与心衰的密切关系2.TNF基因敲除(TNF-/-)小鼠对腹主动脉缩窄介导的心脏重构、炎症反应等均比C57背景鼠轻得多，而且心功能也明显改善3.灌注TNF-α可导致大鼠心肌收缩性明显下降以及心室过度舒张。4.心衰时心脏既是TNF-α作用的靶器官，也是其生物合成的场所。TNF-α的表达水平与心衰的严重性相关，心肌表达TNF-α受体。

ShustermanV,etal.AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2010;298(2):H440-50JobeLJ,etal.AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2009;297(4):H1462-8；SunM,etal.Circulation.2007;115(11):1398-407.422.实验动物水平研究1.转TNF-α基因小鼠出现心衰表423.靶向TNF-α途径治疗心衰现状已上市的TNF-α抑制剂：依那西普（Etanercept）、英利昔单抗（Infliximab）和阿达木单抗（Adalimumab）等大分子蛋白药物。其机制为竞争性和TNF-α结合，阻断TNF-α和细胞表面TNF受体结合，降低TNF-α活性，为非选择性拮抗TNF-α作用。其临床适应症主要为类风湿性关节炎等，以往缺乏单纯治疗心衰治疗的大样本临床资料。Nurmoham等近期对10.9万RA患者（其中4.8万例暴露于抗TNF治疗)的大样本回顾性研究明确：抗TNF治疗与未用TNF治疗相比显著减少包括心衰在内的多种CV事件发生的风险。

Nurmoham,etal.AnnRheumDis2012;71(Suppl3):52

。433.靶向TNF-α途径治疗心衰现状已上市的TNF-α抑制剂43（三）研究TNFR1亚型及胞外区的意义TNF受体:目前发现的有TNFR1和TNFR2，两种都为跨膜蛋白。TNFR1及TNFR2胞外区有30%同源性，胞内区无同源性，提示二者介导不同的信号转导机制,TNFR1是TNF-α引发炎症反应的主要受体，也是心衰过程中心脏的主要表达受体。TNFR2不能直接激活胞内信号通路,亦有研究认为激活TNFR2有助于心衰治疗。利用高选择性多肽或选择性小分子抑制剂区分TNFR1不同胞外TNF-α结合区，分别研究TNFR1不同胞外区介导的相关的胞内信号机制，有望发现适合治疗心衰新的靶点、信号途径及相关靶基因。44（三）研究TNFR1亚型及胞外区的意义TNF受体:目前发现的44ChenG,GoeddelDV.TNF-R1signaling:abeautifulpathway.Science.2002;296(5573):1634-5TNF受体途径1）TNF－α与TNFR1胞外区结合，使TNFR1形成三聚体。

2）三聚体TNFR1通过其聚集的胞内区死亡结构域（DD）招募下游信号传导蛋白（TRADD、FADD、TRAF2、RIP）。

3）下游信号传导蛋白形成复合体，激活下游的caspase8以及各种效应分子caspases，产生级联激活反应，最终引起靶细胞凋亡。

4）TNF还可通过下游激活蛋白RIP，TRAF2等，分别激活NIK和MEKK，从而激活NF－KB和c－Jun，抑制细胞凋亡。ChenG,GoeddelDV.TNF-R1sig45TNFR1主要通过第2、3功能区（CRD2,CRD3)与TNF-α相互识别，TNF-α与TNFR1的识别的两个关键位点分别位于CRD2和CRD3的A1模块,关键的作用位点存在于A1模块的疏水区,目前对于TNFR1的研究及TNFR1抑制剂的设计和开发主要集中在这2个功能区，特别是针对CRD3已研究出选择性及抗炎效价较高的环肽抑制剂（YCWSQYLCY,C-C），但并没有进行治疗心衰效果评价。

TakasakiW,etal.NatBiotechnol1997;15:1266-70MukaiY,etal.JMolBiol2009;385:1221-9

46TNFR1主要通过第2、3功能区（CRD2,CRD3)与T46CRD4亦有非常保守的A1模块结构，针对于CRD4A1模块结构疏水区域的作用研究对于客观认识TNF-α和TNFR1的结合模式我们以TNF-R1的胞外CRD4区的A1模块疏水区为模板，设计合成TNFR1衍生小肽序列，并对其进行活性测试，筛选出对TNF-αCRD4区有较高亲和力，可以通过对TNF-α的识别及阻断作用抑制TNF-α信号传导较高活性肽Pep3，动物实验显示出比Etanercept更好的治疗心衰效果，申请并已获得专利授权。CaoY,LiuP*.AsyntheticpeptidederivedfromA1moduleinCRD4ofhumanTNFreceptor-1inhibitsbindingandproinflammatoryeffectofhumanTNF-alpha,Inflammation,2009,32:139-145一种多肽及其在制备抗心衰和炎性反应药物中的应用，中国发明专利授权号：ZL200810218732.2；发

明

(设计)人：刘培庆;蒋建敏;曹颖男CRD4亦有非常保守的A1模块结构，针对于CRD4A147四.针对TNF-α及其受体TNFR1的研究我们利用心梗致心衰大鼠模型比较了Etanercept和我们前期筛选到的TNFR1CRD4区抑制剂Pep3，发现尽管Etanercept抑制TNF-α活性作用高于Pep3，但改善心脏功能作用不及Pep3。TNFR1可与TNF-α结合的胞外端包括CRD3区和CRD4区，是否TNF-α与TNFR1CRD3区、CRD4区结合介导的胞内信号机制、靶基因及转录调控不同？针对TNF-α受体及亚型的选择性抑制更有利于心衰治疗？

四.针对TNF-α及其受体TNFR1的研究我们利用心梗致心衰48(一）建立了针对TNFR1CRD4区多肽合成、多肽表征鉴定及活性筛选体系1.肽库的设计及多肽合成以I型TNF受体（TNFR1）N端胞外第四区域（Domain4）的天然结构为目标，应用组合化学、多肽固相合成技术，结合现代合成、分离纯化技术，建立各种不同的多肽衍生物，通过各种波谱分析及HPLC等确定它们的结构纯度。小分子肽的合成采用固相Fmoc法，选用2-Chlorotritylchloride树脂作为固相载体，N,N-二甲基甲酰胺做溶剂，缩合试剂选用二异丙基碳二亚胺，使用ReagentB切除肽链和侧链保护基，有关合成技术已经完善。49(一）建立了针对TNFR1CRD4区多肽合成、多肽表征鉴定49图1.

固相Fmoc法合成肽链示意图

50图1.固相Fmoc法合成肽链示意图50502.建立了合成多肽分子量的ESI-MS质谱表征分析、多肽纯度的HPLC表征分析、合成的粗产品HPLC纯化方法及活性分析TNF-αbinding实验方法254nm214nmFig.2.HPLCanalysisofPep3at254nmand214nm.Fig.3.ESI-MSanalysisofPep3512.建立了合成多肽分子量的ESI-MS质谱表征分析、多513.证明了已合成的优选多肽Pep3具有较高的抑制TNF-α与TNF-R1的结合活性、抑制HeLa细胞IκB-α降解及NF-κBp65核转位。Fig.4.InhibitionofTNF-αbindingtoTNF-R1bysyntheticpeptidesinELISA.Fig.5.EffectofPep3onTNF-α-induceddegradationofIκB-αinHeLacells.Fig.6.EffectofPep3onTNF-α-inducedNF-κBp65subunitnucleartranslocation.Cao,Y,Liu,P*(刘培庆，通讯作者).AsyntheticpeptidederivedfromA1moduleinCRD4ofhumanTNFreceptor-1inhibitsbindingandproinflammatoryeffectofhumanTNF-alpha,Inflammation,2009,32:139-145523.证明了已合成的优选多肽Pep3具有较高的抑制TNF-α52YuS,LiuP.*(刘培庆，通讯作者).Sirtuin6protectscardiomyocytesfromhypertrophyinvitroviainhibitionofNF-kappaB-dependenttranscriptionalactivity,BrJPharmacol,2012.DOI:10.1111/j.1476-5381.2012.01903.x④发现Sirt6通过以酶活性依赖性方式抑制NF-κB的转录激活发挥抑制心肌肥大及炎性反应的作用53YuS,LiuP.*(刘培庆，通讯作者).Sirtu53⑥建立了巨噬细胞炎症反应模型，为从炎性病变角度研究心衰提供了技术支持。XuS,LiuPQ*（刘培庆，通讯作者）.TanshinoneII-AinhibitsoxidizedLDL-inducedLOX-1expressioninmacrophagesbyreducingintracellularsuperoxideradicalgenerationandNF-κBactivation.TranslRes.2012Aug;160(2):114-24⑥建立了巨噬细胞炎症反应模型，为从炎性病变角度研究心衰提供了54鉴于TNF-α在心衰过程中的重要作用，TNF-α及其受体TNFR1有望成为心衰治疗的新途径及新靶点！鉴于TNF-α在心衰过程中的重要作用，TNF-α及55六、进一步研究思路通过多肽设计、合成及优化,获得更高活性及选择性多肽研究TNF-α通过TNFR1胞外不同区域介导心衰能量代谢紊乱的机制明确干预TNF-α信号途径治疗心衰可行性，确定具体干预靶点对研发的高活性高选择性多肽进行治疗心衰的药效学评价，为进一步小分子化合物的设计及研发奠定良好的基础。56六、进一步研究思路通过多肽设计、合成及优化,获得更高活性及56短肽库TNR1活性测试（试剂盒）有机合成靶标（

TNFR1）专利多肽Pep3构效关系分析优选多肽Pepx合理化设计结构优化细胞活性测试（IC50）小分子抑制剂合理化设计1.多肽设计、合成及优化短肽库TNR1活性测试（试剂盒）有机合成靶标专利多肽Pep57TNFReceptor1、TNF

和小分子抑制剂的模建作用模式基于晶体结构：1FT4和1TNR58TNFReceptor1、TNF和小分子抑制剂的模建作58TNF

小分子抑制剂的发现（设计、合成和活性测试）活性测试分子动力学模拟分子对接小分子数据库大于40万化合物苗头化合物目标化合物结构改造有机合成活性测试先导化合物59中国天然产物数据库（CNPD）TNF小分子抑制剂的发现（设计、合成和活性测试）活性测试分59(A)ChemicalstructureofthesmallmoleculeTNF-αinhibitor.See(12)forsyntheticrouteused.(B)CompoundinhibitionofTNF-αbindingtoTNFR1invitro.AnELISA(12)wasusedtomeasureinhibitionofsolution-phaseTNF-R1horseradishperoxidaseconjugatebindingtobiotinylatedTNF-αimmobilizedonastrepavidin-coatedmicrotiterplatebyserialdilutionsofcompound.Thesolidlinerepresentsafour-parametercurvefit(20)thatyieldedanIC50valueof22μM.(C)CompoundinhibitionofTNF-αinducedIκB-αdepletioninHeLacells.CellsweretreatedwithsufficientTNF-αorIL-1βtogivean80%ofmaximalIκB-αdepletionresponseaftera30-minexposure(0.4and0.04ng/ml,respectively),asmeasuredinanassayofcelllysates(12).SolidcirclesshowthatcompoundadditioninhibitsthisTNF-α–inducedIκB-αdepletionandyieldsanIC50valueof4.6μM.OpencirclesshowthatcompoundadditiondoesnotaffectorthogonalIL-1β–inducedIκB-αdepletion.Errorbarsindicatestandarddeviationsfortriplicatemeasurements.二甲基胺为隔离基相联结的三氟甲基苯基吲哚和二甲基色酮能够抑制TNF-α和它的受体之间的链接。抑制TNF-α与TNFR1结合IC50为22μmol/L，而抑制TNF-α诱导的IκB-α解离IC50为4.6μmol/L。(A)Chemicalstructureofthe602.正在进行TNF

小分子抑制剂的研发工作通过与本院“结构生物学与药物设计实验室”罗海彬教授课题组合作，以靶蛋白及其受体的复合晶体结构为模板，进行“TNFReceptor1、TNF和小分子抑制剂的模建作用模式及TNF

小分子抑制剂的设计、合成和活性测试”。双方已有良好合作基础，共同发表文章如下，为靶向TNF及其受体的小分子抑制剂研发奠定了良好基础。LiuM,HeL,HuX,LiuP,LuoHB.3D-QSAR,homologymodeling,andmoleculardockingstudiesonspiropiperidinesanaloguesasagonistsofnociceptin/orphaninFQreceptor.BioorgMedChemLett.2010;20(23):7004-7010ChenSK,ZhaoP,ShaoYX,LiZ,ZhangC,LiuP,LuoHB,HuX.MoracinMfromMorusalbaL.isanaturalphosphodiesterase-4inhibitor.BioorgMedChemLett.2012;22(9):3261-3264.ShaoYX,ZhaoP,LiZ,LiuM,LiuP,LuoHB.ThemolecularbasisfortheinhibitionofhumancytochromeP4501A2byoroxylinandwogonin.EurBiophysJ.2012;41(3):297-306.612.正在进行TNF小分子抑制剂的研发工作通过与本院“结构61(A)X-raycrystallographystructureoftheTNF-αdimer–compoundcomplex.(B)ShiftinsubunitorientationwithintheTNF-αdimer–compoundcomplex.SuperpositionoftheTNF-αtrimerstructure(gray)withtheTNF-αdimer–compoundcomplexstructure(yellow-blue)showsaslightwideningintheanglebetweenthesubunitsatthecompoundbindingsite.(C)ViewofcompoundbindingsiteontheTNF-αdimer.Imageshowsthe2Fo–Fcelectrondensityomitmapofthecompound(contouredto1σ)calculatedfromphasesderivedfromrefinementofthestructurewithoutcompound(mesh).ThebindingpocketcanbeseentocompriseresiduesfrombothchainA(yellow)andchainB(blue).(D)βsheetsecondarystructurearoundthecompoundbindingsiteandthelocationofsixtyrosineresiduesthatcontactthecompound.Thetyrosinesarecolored-codedwithTyr59(tan),Tyr151(purple),andTyr119(blue)residuesbeingpresentedfrombothchainAandchainB.具有TFN-α的化合物的X射线晶体结构测定表明抑制剂取代了蛋白质的3个亚单元并与TNF-α亚单元二聚体形成配合物。研究者认为,在研究因蛋白质解离而使复杂蛋白质失活的小分子抑制剂时,这个结果将有助于鉴定用试样的设计。(A)X-raycrystallographystru62①我们用蛋白差异表达技术研究了SHR与2k2cRHR心肌肥大大鼠心肌组织蛋白组学，发现了18个差异表达蛋白，其中12个是能量代谢密切的酶,为心肌肥大及心衰的能量代谢异常学说提供了重要依据。②建立了慢性心衰能量代谢相关的信号通路、基因及线粒体功能、核转录调控、表观遗传等分析方法，证明了能量代谢异常在心肌肥大及心衰病理过程中的重要性③研究了NAD合成的限速酶在心肌肥大中点变化及调控机制④发现Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶（Sirt）通过以酶活性依赖性方式抑制NF-κB的转录激活发挥抑制心肌肥大作用，为心肌肥大的炎性反应及心衰的表观遗传调控提供了依据⑤对心肌肥大及心衰病理过程中细胞内信号分子的相互作用及网络联系进行了系统研究，特别是核受体及转录因子的调控分析，证明了PPARα、NFATc4及GATA-4之间相互作用。⑥建立了巨噬细胞炎症反应模型，证明了中药单体丹参酮ⅡA主要通过抑制细胞内NF-κB的转录激活发挥抑制炎症反应作用，为从炎性病变角度研究心衰提供了技术支持①我们用蛋白差异表达技术研究了SHR与2k2cRHR心肌肥63主要内容正常心肌能量代谢CHF心肌能量代谢变化CHF的代谢疗法展望主要内容正常心肌能量代谢CHF心肌能量代谢变化C64正常心肌的能量代谢过程（三）：ATP的转移和利用心脏收缩肌酸激酶能量穿梭机制

MitochondriacytoplasmATPADP+线粒体肌酸激酶+肌酸（Cr）

磷酸肌酸（PCr）肌纤维肌酸激酶ADP+

磷酸肌酸（PCr）+肌酸（Cr）ATP正常心肌的能量代谢过程（三）：ATP的转移和利用心脏收缩肌M65能量代谢与心肌肥大心衰关系①我们用蛋白差异表达技术研究了SHR与2k2cRHR心肌肥大大鼠心肌组织蛋白组学，发现了18个差异表达蛋白，其中12个是能量代谢密切的酶,为心肌肥大及心衰的能量代谢异常学说提供了重要依据。②建立了慢性心衰能量代谢相关的信号通路、基因及线粒体功能、核转录调控、表观遗传等分析方法，证明了能量代谢异常在心肌肥大及心衰病理过程中的重要性③研究了NAD合成的限速酶在心肌肥大中点变化及调控机制④发现Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶（Sirt）通过以酶活性依赖性方式抑制NF-κB的转录激活发挥抑制心肌肥大作用，为心肌肥大的炎性反应及心衰的表观遗传调控提供了依据⑤对心肌肥大及心衰病理过程中细胞内信号分子的相互作用及网络联系进行了系统研究，特别是核受体及转录因子的调控分析，证明了PPARα、NFATc4及GATA-4之间相互作用。⑥建立了巨噬细胞炎症反应模型，证明了中药单体丹参酮ⅡA主要通过抑制细胞内NF-κB的转录激活发挥抑制炎症反应作用，为从炎性病变角度研究心衰提供了技术支持能量代谢与心肌肥大心衰关系①我们用蛋白差异表达技术研究了SH66研究背景从心肌肥厚到心力衰竭的发生机制：心肌细胞功能异常：收缩蛋白等；心肌细胞数量减少：凋亡，自噬等；心肌微血管障碍；细胞外间质增加。研究背景从心肌肥厚到心力衰竭的发生机制：67研究背景从心肌肥厚到心力衰竭的发生机制：心肌细胞功能异常：收缩蛋白等；心肌细胞数量减少：凋亡，自噬等；心肌微血管障碍；细胞外间质增加。研究背景从心肌肥厚到心力衰竭的发生机制：68研究背景心肌细胞凋亡是使心肌肥厚从“代偿”向“失代偿”转化的关键因素之一，是心力衰竭进行性恶化的重要基础。心肌细胞自噬是心肌对压力超负荷的适应性反应之一；自噬反应的异常也是导致心脏功能低下的原因。中药“芪苈强心胶囊”治疗慢性心衰实验研究文献资料：邹云增，上海市心血管病研究所研究背景心肌细胞凋亡是使心肌肥厚从“代偿”向“失代偿”转化的69心肌细胞凋亡与心力衰竭WT:WildtypemiceRyR-2+/-:Ryanodinereceptor2knockoutmiceSham:ShamoperationTAC:TransverseaortaconstrictionHypertensioninRevising心肌细胞凋亡与心力衰竭WT:WildtypemiceS70WT:WildtypemiceRyR-2+/-:Ryanodinereceptor2knockoutmiceSham:ShamoperationTAC:Transverseaortaconstriction心肌细胞凋亡与心力衰竭WT:WildtypemiceSham:Shamo71心肌细胞自噬与心力衰竭WT:WildtypemiceRyR-2+/-:Ryanodinereceptor2knockoutmiceSham:ShamoperationTAC:Transverseaortaconstriction心肌细胞自噬与心力衰竭WT:WildtypemiceS72芪苈强心胶囊对压力超负荷2周心肌细胞肥大的影响芪苈强心胶囊对压力超负荷2周心肌细胞肥大的影响73芪苈强心胶囊对压力超负荷4周心肌纤维化的影响芪苈强心胶囊对压力超负荷4周心肌纤维化的影响74芪苈强心胶囊对压力超负荷4周心肌细胞凋亡的影响(TUNEL)芪苈强心胶囊对压力超负荷4周心肌细胞凋亡的影响(TUNEL)75芪苈强心胶囊对压力超负荷4周心肌细胞自噬的影响(LC3b)芪苈强心胶囊对压力超负荷4周心肌细胞自噬的影响(LC3b)76#*###芪苈强心胶囊对压力超负荷4周心肌细胞自噬的影响(LC3b)#*###芪苈强心胶囊对压力超负荷4周心肌细胞自噬的影响(L77小结芪苈强心胶囊：—延缓压力超负荷后心室重构的发生；—保护压力超负荷后的心脏收缩功能；—减少压力超负荷晚期的心肌细胞凋亡和自噬小结芪苈强心胶囊：78四、进一步研究思路通过多肽设计、合成及优化,获得更高活性及选择性多肽研究TNF-α通过TNFR1胞外不同区域介导心衰能量代谢紊乱的机制明确干预TNF-α信号途径治疗心衰可行性，确定具体干预靶点对研发的高活性高选择性多肽进行治疗心衰的药效学评价，为进一步小分子化合物的设计及研发奠定良好的基础。79四、进一步研究思路通过多肽设计、合成及优化,获得更高活性及79短肽库TNR1活性测试（试剂盒）有机合成靶标（

TNFR1）专利多肽Pep3构效关系分析优选多肽Pepx合理化设计结构优化细胞活性测试（IC50）小分子抑制剂合理化设计1.多肽设计、合成及优化短肽库TNR1活性测试（试剂盒）有机合成靶标专利多肽Pep80TNFReceptor1、TNF

和小分子抑制剂的模建作用模式基于晶体结构：1FT4和1TNR81TNFReceptor1、TNF和小分子抑制剂的模建作81TNF

小分子抑制剂的发现（设计、合成和活性测试）活性测试分子动力学模拟分子对接小分子数据库大于40万化合物苗头化合物目标化合物结构改造有机合成活性测试先导化合物82TNF小分子抑制剂的发现（设计、合成和活性测试）活性测试分82(A)ChemicalstructureofthesmallmoleculeTNF-αinhibitor.See(12)forsyntheticrouteused.(B)CompoundinhibitionofTNF-αbindingtoTNFR1invitro.AnELISA(12)wasusedtomeasureinhibitionofsolution-phaseTNF-R1horseradishperoxidaseconjugatebindingtobiotinylatedTNF-αimmobilizedonastrepavidin-coatedmicrotiterplatebyserialdilutionsofcompound.Thesolidlinerepresentsafour-parametercurvefit(20)thatyieldedanIC50valueof22μM.(C)CompoundinhibitionofTNF-αinducedIκB-αdepletioninHeLacells.CellsweretreatedwithsufficientTNF-αorIL-1βtogivean80%ofmaximalIκB-αdepletionresponseaftera30-minexposure(0.4and0.04ng/ml,respectively),asmeasuredinanassayofcelllysates(12).SolidcirclesshowthatcompoundadditioninhibitsthisTNF-α–inducedIκB-αdepletionandyieldsanIC50valueof4.6μM.OpencirclesshowthatcompoundadditiondoesnotaffectorthogonalIL-1β–inducedIκB-αdepletion.Errorbarsindicatestandarddeviationsfortriplicatemeasurements.二甲基胺为隔离基相联结的三氟甲基苯基吲哚和二甲基色酮能够抑制TNF-α和它的受体之间的链接。抑制TNF-α与TNFR1结合IC50为22μmol/L，而抑制TNF-α诱导的IκB-α解离IC50为4.6μmol/L。(A)Chemicalstructureofthe832.正在进行TNF

小分子抑制剂的研发工作通过与本院“结构生物学与药物设计实验室”罗海彬教授课题组合作，以靶蛋白及其受体的复合晶体结构为模板，进行“TNFReceptor1、TNF和小分子抑制剂的模建作用模式及TNF

小分子抑制剂的设计、合成和活性测试”。双方已有良好合作基础，共同发表文章如下，为靶向TNF及其受体的小分子抑制剂研发奠定了良好基础。LiuM,HeL,HuX,LiuP,LuoHB.3D-QSAR,homologymodeling,andmoleculardockingstudiesonspiropiperidinesanaloguesasagonistsofnociceptin/orphaninFQreceptor.BioorgMedChemLett.2010;20(23):7004-7010ChenSK,ZhaoP,ShaoYX,LiZ,ZhangC,LiuP,LuoHB,HuX.MoracinMfromMorusalbaL.isanaturalphosphodiesterase-4inhibitor.BioorgMedChemLett.2012;22(9):3261-3264.ShaoYX,ZhaoP,LiZ,LiuM,LiuP,LuoHB.ThemolecularbasisfortheinhibitionofhumancytochromeP4501A2byoroxylinandwogonin.EurBiophysJ.2012;41(3):297-306.842.正在进行TNF小分子抑制剂的研发工作通过与本院“结构84(A)X-raycrystallographystructureoftheTNF-αdimer–compoundcomplex.(B)ShiftinsubunitorientationwithintheTNF-αdimer–compoundcomplex.SuperpositionoftheTNF-αtrimerstructure(gray)withtheTNF-αdimer–compoundcomplexstructure(yellow-blue)showsaslightwideningintheanglebetweenthesubunitsatthecompoundbindingsite.(C)ViewofcompoundbindingsiteontheTNF-αdimer.Imageshowsthe2Fo–Fcelectrondensityomitmapofthecompound(contouredto1σ)calculatedfromphasesderivedfromrefinementofthestructurewithoutcompound(mesh).ThebindingpocketcanbeseentocompriseresiduesfrombothchainA(yellow)andchainB(blue).(D)βsheetsecondarystructurearoundthecompoundbindingsiteandthelocationofsixtyrosineresiduesthatcontactthecompound.Thetyrosinesarecolored-codedwithTyr59(tan),Tyr151(purple),andTyr119(blue)residuesbeingpresentedfrombothchainAandchainB.具有TFN-α的化合物的X射线晶体结构测定表明抑制剂取代了蛋白质的3个亚单元并与TNF-α亚单元二聚体形成配合物。研究者认为,在研究因蛋白质解离而使复杂蛋白质失活的小分子抑制剂时,这个结果将有助于鉴定用试样的设计。(A)X-raycrystallographystru853.心肌细胞模型指标检测①心肌能量代谢状态及线粒体功能检测:已建立了HPLC及磁共振波谱（mrs）检测心肌高能磷酸化合物PCr和ATP水平的方法:PCr作为输送ATP从线粒体到细胞质的工具，是能量物质的中介，PCr/ATP比值是分析能量代谢的最重要参数，其准确度高于NYHA分级等临床参数和左室EF等功能参数②TMRE染料检测心肌线粒体膜电位、透射电镜观察线粒体功能与生成状态

③心肌细胞脂肪酸、葡萄糖氧化及氧化磷酸化代谢关键基因如PGC-1α、ERRα、PPARα、HIF-1α、PARP1、NF-κB等mRNA等蛋白表达水等变化④测定心肌细胞表面积、检测[3H]亮氨酸摄入率及肥大及心衰相关基因ANF、BNP的mRNA及蛋白表达水平

通过以上指标体系检测,综合分析TNF-α通过是否通过TNFR1不同功能区发挥对肥大重构及缺血心肌能量代谢的调控作用。3.心肌细胞模型指标检测①心肌能量代谢状态及线粒体功能检测864.系统建立治疗心衰药物的基础研究及评价体系

①超声心动及心脏插管法检测心脏收缩及舒张功能②心肌高能磷酸化合物PCr和ATP水平HPLC及磁共振波谱（mrs）检测方法③TMRE染料检测心肌线粒体膜电位、透射电镜观察线粒体功能与生成状态

④Clark氧电极法检测心肌线粒体耗氧速率⑤脂肪酸、葡萄糖氧化及氧化磷酸化代谢关键基因及蛋白如PGC-1α、ERRα、PPARα、HIF-1α、PARP1、NF-κB等变化；874.系统建立治疗心衰药物的基础研究及评价体系

①超声心动及心872.TNFR1不同胞外区介导的胞内信号机制利用培养的心肌细胞，以不同浓度TNF-α为诱导剂诱导细胞炎性反应及能量代谢障碍，比较分别给予Pepx（作用于CRD4）和环肽（C-C，作用于CRD3），观察对细胞功能和能量代谢主要指标的影响，研究TNF-α通过TNFR1不同胞外区介导的相关的胞内信号机制，探讨TNF-α调控心肌能量代谢的受体机制及信号通路。882.TNFR1不同胞外区介导的胞内信号机制利用培养的心肌细883.干预TNFR1不同胞外区对模型动物心衰治疗效果评价及机制研究1）利用冠状动脉左前降支结扎复制SD大鼠心衰模型，经超声心动图、血流动力学分析以及组织病理检测等方法检测Pepx和环肽（C-C）对心脏功能的影响，探讨干预TNFR1与TNF-α结合的不同胞外区对心衰治疗效果，明确干预TNF-α信号途径治疗心衰的靶点，并进行治疗心衰的药效学评价指标体系：增加Clark氧电极法检测心肌线粒体耗氧速率，其他指标同心肌细胞。2）Beagle犬建立慢性快速右心室起搏心衰模型，进行优选多肽Pepx或筛选出的先导化合物的抗心衰作用药效学评价指标体系：增加犬冠脉流量测定及心肌酶谱检测，其它同大鼠心衰模型893.干预TNFR1不同胞外区对模型动物心衰治疗效果评价及机89研究内容概括如下研究内容概括如下90三、工作基础近年来在负责的6项国家自然科学基金面上项目(包括中加合作项目)及广东省自然科学基金团队项目、重点项目支持下，围绕高血压心肌肥大、心衰等进行了系统的病理机制及药物干预靶点研究，建立了心肌肥大、心衰研究模型及靶点研究方法。负责承担了科技部十一五“重大新药创制”专项“新药临床前药效学评价技术平台”（2009ZX09303-007）“心脑血管疾病药物药效学评价平台”建设，建立了完善的治疗心衰等心脑血管疾病药物临床前药效学评价模型及技术体系（已顺利结题）。三、工作基础近年来在负责的6项国家自然科学基金面上项目(包括913.建立了心衰评价模型及药效评价指标体系①大鼠心衰模型及评价指标体系:冠状动脉左前降支结扎的SD大鼠心衰模型ChenY,LiuP*.MolCellEndocrinol.2012;362(1-2):11-18②Beagle犬建立慢性快速右心室起搏心衰模型及评价指标体系，完成了中药单体前胡丙素及1类化药TBN(暨南大学委托）的抗心衰药效学评价。3.建立了心衰评价模型及药效评价指标体系①大鼠心衰模型及评92（三）开展了治疗心衰药物的研发工作指导了本课题直接相关的博士研究生曹颖男顺利毕业并已获得博士学位，学位论文题目《多肽类肿瘤坏死因子alpha抑制剂的设计、合成及抗炎活性研究》，为本课题的实施奠定了良好基础。获得了活性多肽Pep3在制备抗心衰和炎性反应药物中的应用的中国发明专利授权号，为进一步作为治疗心衰药物研发提供了知识产权保护。93（三）开展了治疗心衰药物的研发工作指导了本课题直接相关的博士931.JCardiovascPharmacol.2012Jun;59(6):500-6.doi:10.1097/FJC.0b013e31824c853c.AtorvastatinattenuatesTNF-α-inducedincreaseofglucoseoxidationthroughPGC-1αupregulationincardiomyocytes.GaoF,NiY,LuoZ,LiangY,YanZ,XuX,LiuD,WangJ,ZhuS,ZhuZ.DepartmentofCardiology,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing,China.Recentstudieshaveshownthatatorvastainhasanti-inflammatoryeffectandcanpreventcardiachypertrophy.Thedevelopmentofcardiachypertrophyanddysfunctionisassociatedwithanincreaseincardiacglucoseutilization.Inthisstudy,weinvestigatedtheeffectofatorvastatinonglucoseoxidationintumornecrosisfactorα(TNF-α)-stimulatedcardiomyocytes(H9c2cells)andthepotentialroleofperoxisomeproliferation-activatedreceptorcoactivator1α(PGC-1α)inthiseffect.ExposureofH9c2cellstoTNF-αinhibitedtheexpressionsofPGC-1α,pyruvatedehydrogenasekinase4,andcarnitinepalmityltransferase1andinducedasignificantincreaseinglucoseoxidationrate.However,theeffectsofTNF-αweresignificantlyreversedbyatorvastatin.SelectivesilenceofPGC-1αinH9c2cellsresultedinthedownregulationofpyruvatedehydrogenasekinase4andcarnitinepalmityltransferase1andfurtherincreasedtheTNF-α-inducedglucoseoxidation.Interestingly,theeffectofatorvastatinonPGC-1αwasalmostabolishedbymevalonateandpartiallybyfarnesolbutnotbygeranylgeraniol.Inconclusion,atorvastatininhibitsTNF-α-inducedglucoseoxidationthroughPGC-1αupregulationincardiomyocytes,whichmightbeassociatedwiththeregulationofisoprenoidmetabolites.1.JCardiovascPharmacol.20194AIMS:Inflammatoryresponsesintheheartthataredrivenbysustainedincreasesincytokineshavebeenassociatedwithseveralpathologicalprocesses,includingcardiachypertrophyandheartfailure.Emergingdatasuggestalinkbetweencardiomyopathyandmyocardialmetabolismdysregulation.Tofurtherelucidatetherelationshipbetweenapro-inflammatoryprofileandcardiacmetabolismdysregulation,ahumancelllineofcardiacorigin,AC16,wastreatedwithtumournecrosisfactor-alpha(TNF-alpha).METHODSANDRESULTS:ExposureofAC16cellstoTNF-alphainhibitedtheexpressionofperoxisomeproliferator-activatedreceptorcoactivator1alpha(PGC-1alpha),anupstreamregulatoroflipidandglucoseoxidativemetabolism.Studiesperformedwithcardiac-specifictransgenicmice(Musmusculus)overexpressingTNF-alpha,whichhavebeenwellcharacterizedasamodelofcytokine-inducedcardiomyopathy,alsodisplayedreducedPGC-1alphaexpressionintheheartcomparedwiththatofcontrolmice.ThemechanismbywhichTNF-alphareducedPGC-1alphaexpressioninvitroappearedtobelargelymediatedviabothp38mitogen-activatedproteinkinaseandnuclear