《天然药物分析》6章HPLC

《中药（天然药物）分析》

第六章

高效液相色谱法的应用1高效液相色谱法具有应用范围广的优点，表现在：（1）HPLC不受试样挥发性和相对分子质量的限制，可用于分离高沸点、相对分子量大、热稳定性差的有机化合物，还可用于各种离子的分离；（2）HPLC不仅可利用被分离组分的极性差别，还可利用组分分子尺寸大小的差别、离子交换能力的差别以及生物分子间亲和力的差别进行分离。它还可以用多种溶剂作为流动相，对于性质和结构类似的物质，分离的可能性比气相色谱法更大；（3）HPLC易于收集流出物组分，可利用制备柱进行较大量的制备。2第一节高效液相色谱的技术参数

一．速率理论

图6-1是气相色谱法和高效液相色谱法的H-µ曲线。由图可见，两者形状明显不同。HPLC法接近一条直线，而气相色谱法曲线中有一极小值。

图6-1GC和HPLC的典型H-μ曲线

3在HPLC中，由于流动相是液相，影响柱效的因素与GC不完全相同。因此，范第姆特方程（H=A+B/µ+Cµ）应作修正。在范第姆特方程中，HPLC与GC的涡流扩散项完全相同。HPLC的分子扩散项是因同种组分分子由浓度大的谱带中心向浓度较低的两边扩散所引起。它与组分分子的流动相中的扩散系数（Dm）成正比，与流动相的平均线速（µ）成反比。由于液相中扩散系数要比气相中小4~5个数量级，HPLC中该相对于谱带扩张的影响可以忽略不计。4

HPLC的传质阻力是由组分在两相间的传质过程实际上不能瞬间达到平衡而引起的，其传质阻力相包括三项：固定相传质阻力（Hs），移动流动相传质阻力（Hm）和滞留流动相传质阻力（Hsm），即:5气相色谱法主要考虑固定相的传质阻力；液相色谱法与之不同，在整个传质过程中起主要作用的是流动相传质阻力，特别是滞留流动相的传质阻力，因此，改进固定相结构，减小滞留流动相传质阻力是提高液相色谱柱效的关键。以上各项可归纳为：其中CdDm/u相实际上可以略去。于是，上式可简写为：6

要想提高液相色谱法的柱效，必须用小而均匀的固定相颗粒且要填充均匀，以减小涡流扩散和流动相传质阻力。改进固定相的结构，对于减小滞留流动相传质阻力以及固定相传质阻力至关重要。此外，选用低黏度的流动相（如甲醇、乙腈等），也有利于减小传质阻力，提高柱效。

7二．柱外效应

柱外效应（extracolumneffect）是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，又称柱外展宽。它分为柱前和柱后两种。1．柱前展宽主要由进样引起。HPLC进样常采用两种方式：阀门进样，试样由流动相带入柱内，进样阀有死体积，会引起峰的展宽；注射进样，将试样注入液流中，或注入填料顶端，进样器内的死体积和进样时液体扰动而引起的扩散，均会引起峰的展宽。减小进样阀的死体积，或者将试样直接注射到填料顶端中心点或中心点以内1~2mm处，可减少柱前的扩散，使柱效显著提高。82．柱后展宽

是由接管和检测器流通池以及检测器响应时间等因素引起。流动相在接管中心流速较大，而管壁附近流速较慢，管中心处组分比管壁部分先到达检测器，引起峰的展宽。因此尽可能用短的接管，减少流通池体积，可以提高柱效。检测器、放大器和记录仪响应较慢，也会使描绘的色谱峰宽增加，峰高降低，对于保留值较小的组分影响尤为突出。所以，改进检测器和记录系统的响应速度也是克服柱后展宽的一个途径。9三．分离度

色谱法的关键问题之一，就是难分离组分的分离问题。前已提出，有效塔板数（neff），是评价柱效应的一项指标，相对保留值（ris）是衡量色谱柱选择性的另一项指标。但这两项指标未能说明难分离组分的真实分离效果。气相色谱的分离效果可直接表现在色谱的峰间距离和峰宽上，只有相邻两个色谱峰的距离较大、峰宽较窄时，两个组分才能得到良好的分离。综合考虑保留值的差值与峰宽对柱效率的影响，常用分离度作为色谱柱的总分离效能指标，以判断难分离物质对在色谱柱中的分离情况。10分离度用R表示，其定义为：相邻两色谱峰保留值之差与两组分色谱峰峰宽平均值之比值，即：11R越大，两色谱峰距离越远，分离效果越好。R<1时两峰有部分重叠；R=1，两峰有98%的分离；R=1.5时，分离程度可达99.7%。当R=1.5时，为相邻两峰完全分离标志。为了找出影响分离度的主要因素，可由式（6-8），推导出总分离效能方程式，即：（6-9）

式中，：柱效相；：柱选择相；容量因子相。

12不同分离度比较PoorefficiencyModerateselectivityPoorefficiencyGoodselectivityExcellentefficiencyPoorselectivityExcellentefficiencyModerateselectivityR=1R=1.5R=0.5R=413如何提高分离度1.通过下列方法增加保留时间（1）选择合适的分离参数（2）增加色谱柱长度（3）增加固定相浓度2.通过下列方法降低谱带宽度（1）使用均一的载体（2）仔细填充色谱柱（3）选择粒度小载体（4）优化流速（5）减少进样量（6）降低系统死体积（7）降低输出回路响应时间14四．系统适应性试验

（1）色谱柱的理论塔板数n：按n=5.54（tR/W1/2）2计算色谱柱的理论塔板数（2）分离度R：定量分析时，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度，一般R≥1.5。（3）重复性：取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0％（4）拖尾因子T：拖尾因子计算公式T=W0.05h/2d1T应在0.95~1.05之间。

15第二节高效液相色谱的实验技术

高效液相色谱进样口检测器色谱图色谱柱溶剂泵混合器

16一．色谱系统

1.高压泵

高压泵是输液系统最重要的部件。理想的泵应当是：（1）输出流量恒定，无脉动，且有较大的可调范围；（2）输出压力高而且平稳；（3）死体积小，便于迅速更换溶剂和采用梯度洗脱；（4）耐腐蚀，保养维修简便，寿命长。

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2.梯度洗脱装置HPLC有等度洗脱和梯度洗脱两种洗脱方式：前者保持流动相组成配比不变；后者则在洗脱过程中连续或阶段的改变流动相组成，它需要配有梯度洗脱装置。梯度洗脱装置有两类：（1）低压梯度，又称外梯度。先混合后加压，即按一定程序在常压下预先将溶剂混合后，再用泵加压输入色谱柱。其优点是只需一台泵，价廉。（2）高压梯度，又称内梯度。先加压，后混合，即用几台泵分别将不同溶剂加压，按程序规定的流量比例输入混合室混合，再使之进入色谱柱。其优点是方便，能得到任意类型的梯度曲线，易于自动化；但至少需两台泵，价格较高。18

4.色谱柱色谱柱是HPLC最重要的部件，由柱管和固定相构成。它的作用是分离。HPLC的色谱柱管通常为内壁抛光的不锈钢管，形状几乎全为直形。近年来由于微粒填料和高压匀浆装柱技术的应用，大大提高了柱效。所用色谱柱都比较短（5~30cm），柱内径根据需要而异；一般分析柱，内径4~5mm：凝胶色谱柱，内径3~12mm；制备柱内径较大，可达25mm以上。

195.检测器

（1）紫外-可见光检测器

有固定波长型和可调波长型两类。紫外检测器灵敏度较高，但要求试样必须有紫外吸收，而且溶剂必须能透过所选波长的光，选择的波长不能低于溶剂的最低使用波长。20紫外－可见检测器I0=入射光强度I=透射光强度A=吸光度a=摩尔吸光系数b=检测池长度c=溶质浓度IICboDetectorCellLog=A=abcI0I21（2）光电二极管阵列检测器（DAD）是80年代出现的一种光学多通道的检测器，在晶体硅上紧密排列一系列的光电二极管，二极管越多分辨率越高。一般是一个二极管对应的接受光谱上一个纳米谱带宽的单色光。二极管阵列检测器的工作原理是复光通过流动池时，被组分选择性的吸收，再进入单色器，照射在二极管阵列装置上，使每个纳米波长的光强变成相应的电信号强度，通过计算机的处理，从而获得三维光谱—色谱图。吸收光谱用于组分的定性，色谱峰用于定量，在中药成分的研究中有广泛的应用。22定性分析--峰纯度检验pureimpure7.67.88.08.28.4Time(min)200400Wavelength(nm)PurityMatch764200400Wavelength(nm)PurityMatch999AbsorbanceAbsorbance23（3）示差折光率检测器（differentialrefractiveindexdetector）利用流动相中出现试样组分时引起折光率的变化进行检测的。示差折光率检测器是通用型的，可对所有溶质都响应，其缺点是不能用于梯度洗脱，且灵敏度较低。由于折光率随温度变化，示差折光率检测器必须控制恒温，一般用于无紫外吸收物质分析。

24（4）荧光检测器主要特点是高灵敏度，高选择性，样品用量少。但相当多的物质不产生荧光，其应用受到一定限制。（5）电化学检测器（electrochemicaldetector）电极活性组分流进检测器即发生电解，产生的电流经放大而被检测。非电极活性物质不干扰测定，因而选择性很高。检出限达pg级。（6）电导检测器（conductivitydetector）是离子色谱法应用最多的检测器。对于分子不响应，对于离子则是通用型的。电导检测器要求温度恒定，需放在恒温箱中。双示差电导检测器消除了温度变化的影响，可测定10-9mol/L的阴离子，也可编程控制温度。

25（7）蒸发光散射检测器（evaporativelight-scatterdetector，ELSD）是90年代的通用型检测器，对各种物质几乎同时响应，利用在一定的条件下粒子的数量不变，光散射强度正比于由溶质决定的粒子的大小而进行测量的。这就是：样品结构不需要具备紫外发色团和合适的折射率，对梯度洗脱和流动相系统温度变化不敏感；对各种物质的响应因子很近；在一次的分析中可以同时检测主要成分和杂质等。26其工作原理是：将色谱柱流出液引入雾化器与通入的气体混合形成均匀的微小液滴，经过加热的漂移管，蒸发除去流动相，而样品组分形成气溶胶，然后进入检测器。用强光或激光照射气溶胶，产生光散射，用光电二极管检测散射光。但是，其灵敏度比较低，尤其低于有紫外吸收的组分；此外，流动相必须是挥发性的，不能含有缓冲盐类。272843.0%22.0%10.0%8.0%7.0%5.0%1.0%4.0%UV-VISDADFluorescenceRefractiveIndexElectrochemicalConductivityMassspecOthers检测器使用统计29二．色谱分离方式

（一）

吸附色谱法1．原理吸附色谱法（absorptionchromatography）又称液固色谱法（liquid-solidchromatography，LSC），它以固定吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力。试样分子（X）被流动相带入柱内，它将与流动相中的溶剂分子（S）在吸附剂表面发生竞争吸附。

达到平衡时，有

式中，K：吸附平衡常数。K大的强极性组分易被吸附，保留值大，难于洗脱；K小的弱极性组分难被吸附，保留值小，易于洗脱。因此，试样中的各组分被分离。302．固定相

吸附色谱法用的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺等，以硅胶最为常用。硅胶的优点较多，如线型容量较高、机械性能较好、不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等。硅胶的吸附活性是由于硅胶表面的硅醇基产生的。硅胶如吸附水，一部分硅醇基与水分子成氢键而失去活性，致使吸附力降低。升温可以除去吸附剂里的水，使硅胶活化。但是温度不可过高，否则会使硅醇基脱去结构水变成硅醚基，反而降低甚至失去吸附力。通常将硅胶在125~150℃干燥8~16h，干燥器中放冷后加入一定量的重蒸馏水调节活度，然后装柱。313．流动相

流动相的选择是影响HPLC分离效果的主要因素。HPLC所用的流动相又称为洗脱剂（eluant）。吸附色谱法选择流动相的原则是：极性大的试样需用极性强的洗脱剂，极性弱的试样应用极性较弱的洗脱剂。洗脱剂的极性可用Snyder提出的溶剂极性参数Pˊ来表示。实际工作中常用混合溶剂作为洗脱剂，以改善分离效果。在分离复杂试样时，可按一定程序连续的或阶段的改变流动相的组成，这就是梯度洗脱（gradientelution）。它类似于气相色谱法中程序升温所起的作用，能够提高分离效率，改善峰形，加快分析速度。

32流动相的优化优化：指在合理的时间内，所有的流动相能使样品各组分达到足够的分离。“选择合适强度的溶剂是获得分离最佳化的首要条件。”33选择流动相还要注意以下要求，这些要求也适用于其它类型的HPLC：（1）不允许使用能引起柱损失或柱保留特性变化的溶剂。如吸附色谱的流动相不应含水，使用硅胶做填料的色谱柱不能使用碱性溶剂。（2）溶剂纯度要高。使用前应过滤，除去尘埃微粒，以免堵塞，还应除去溶解的气体（称为脱气），以免在柱中或检测器中产生气泡而影响分离和检测。脱气方式34（3）溶剂对于试样要有适量的溶解度，以免试样在柱中沉淀而造成堵塞。更换流动相时必须保证互溶。（4）流动相应与检测器匹配。如用紫外检测器时，流动相本身在检测波长处应当无吸收。溶剂的截止波长（5）尽量使用低粘度溶剂，如甲醇、乙腈等可以提高柱效，还能降低色谱柱的阻力。3536（二）分配色谱法

1．原理分配色谱法（partitionchromatography）又称液液色谱法（liquid-liquidchromatography，LLC），是根据物质在两种互不相溶（或部分互溶）的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。分配系数较大的组分，保留值也较大。37根据固定相和流动相之间的相对极性的大小，可将分配色谱法分为两类：（1）流动相极性低而固定相极性高的，称为正相分配色谱法（normalphasepartitionchromatography）。它对于极性强的组分有较大的保留值，常用于分离强极性化合物。（2）流动相极性大于固定相的，称为反相分配色谱法（reversedphasepartitionchromatography）。它对于极性弱的组分有较大的保留值，适于分离弱极性的化合物。382．固定相

化学键合相（chemicallybondedphase）是利用化学反应将有机分子键合到载体表面，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的。一般用硅胶作载体，采用的键合反应有酯化键合（Si-O-C型）、硅烷化键合（Si-O-Si-C型）和硅氮键合（Si-N型）等。其中，以硅烷化键合反应最为常用

39化学键合相具有以下特点：（1）固定相不易流失，柱的稳定性和寿命较高。（2）能耐各种溶剂，可用于梯度洗脱。（3）表面较为均一，没有液坑，传质快，柱效高。（4）能键合不同基团以改变其选择性，例如键合氰基、氨基等极性基团用于正相色谱法，键合离子交换基团用于离子色谱法等。因此，它是HPLC较为理想的固定相。

40根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，可将键合相色谱法分为正相键合相色谱法和反相键合相色谱法。（1）在正相键合相色谱法中，键合固定相的极性大于流动相的极性，适用于分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物。（2）在反相键合相色谱法中，键合固定相的极性小于流动相的极性，适用于分离非极性、极性或离子型化合物，其应用范围比正相键合相色谱法更广泛。据统计在高效液相色谱法中，约70%~80%的分析任务是由反相键合相色谱法来完成的。

413.流动相

分配色谱法所用流动相的极性必须与固定相显著不同。选择流动相一般靠实验。可以用单一的溶剂，更常用混合溶剂。正相色谱法常用低极性溶剂如烃类，加入适量极性溶剂如氯仿、醇类以调节溶剂极性参数P’，其溶剂系统的选择与吸附色谱法相同。反相色谱法中，溶剂的洗脱能力用溶剂强度因子()表示，其大小顺序与正相色谱的P’相反，通常以水或无机盐缓冲溶液为主体，加入甲醇、乙腈等调节极性。梯度洗脱时，正相色谱法通常逐渐增大洗脱剂中极性溶剂的比例；而反相色谱法则与之相反，逐渐增大极性相对较低的甲醇或乙腈的比例。

424.反相离子对色谱法

离子对色谱法（ionpairchromatography）是20世纪70年代中期发展起来的。其中，反相离子对色谱法应用较多，它是在强极性的流动相中加入与被测离子电荷相反的平衡离子，从而实现色谱分离的。常用的平衡离子试剂有烷基磺酸钠和季铵盐两类，前者适用于分离有机碱类和有机阳离子，后者适用于分离有机酸类和有机阴离子。

43（三）离子色谱法

离子色谱法（ionchromatography，IC）是由经典离子交换色谱法（ionexchangechromatography，IEC）派生出来的。它们都是用能交换离子的材料（例如离子交换树脂）作为固定相，利用它与流动相中试样离子进行可逆的离子交换来分离离子型化合物的方法。1．离子交换原理试样中的离子与离子交换树脂上的离子发生交换反应

442．离子交换色谱法的固定相和流动相

HPLC常用的离子交换填料有以下几种：（1）多孔树脂：直径为10~20µm。其交换容量较高，但有溶胀性，不耐高压，而且表面微孔结构影响传质，柱效较低。（2）薄层树脂：即在30~40µm直径的玻珠表面涂一层离子交换树脂。其柱效较高，耐压，但交换容量低。（3）离子性键合固定相：在硅胶基体表面键合离子交换基团而成，制成5或10µm直径的全多孔微粒。它的机械性强度较高，化学稳定性和热稳定性较好，柱效高，交换容量能符合要求，较为理想。45离子交换色谱法大多用一定的pH和一定浓度的缓冲液作为洗脱剂。分离有机酸碱时，洗脱剂的pH影响酸碱的解离程度，因而影响k。最好将pH选择在被分离的酸碱的pKa附近。缓冲液的离子强度也会影响k。一般来说，离子强度增大，即缓冲溶液浓度增大时，k减小。对于多组分混合物的分离，可以采取改变离子强度或改变缓冲液pH两种梯度洗脱方式。463.电导检测双柱离子色谱法

离子交换色谱法现代化过程中遇到的一个难题是离子的检测。使用紫外、荧光等检测器只能分析某些具有特殊性质的离子。利用电导检测器检测离子具有通用性和灵敏度高的优点，但因洗脱剂中的离子也有响应而难以使用。离子色谱法的发明解决了这个难题，开创了分离分析离子化合物的新局面。双柱离子色谱法又称抑制型离子色谱法。该法在分离柱和电导检测器之间增加了一根抑制柱（suppressorcolumn），柱中填充电荷与分离柱相反的离子交换树脂。洗出液（eluate），即分离柱流出的溶液，进入抑制柱发生抑制反应，除去洗脱剂离子，然后就入检测器。（1）阴离子分析（2）阳离子分析474．电导检测单柱离子色谱法

电导检测单柱离子色谱法又称非抑制型离子色谱法。它只用一根分离柱，不用抑制柱。由于减少了抑制柱带来的死体积，分离效率高，且能用普通的HPLC仪改装。该方法近年来发展更为迅速。单柱离子色谱法的基本原理是：（1）采用了低浓度洗脱剂，降低洗出液的本底电导水平。（2）采用了低容量的离子交换树脂，使保留值保持不变。48离子色谱法具有灵敏度高、选择性好、快速、能同时分析多种离子的优点，特别是对于阴离子的分离分析，在各种仪器分析方法中堪称首选方法。在检测手段方面，除电导检测器以外，还可用柱后衍生技术，使用其他类型的检测器。为了防止微量金属离子的干扰，专用的离子色谱仪通常采用全塑结构。属于离子色谱法的还有离子排斥色谱法（ICE）和流动相离子色谱法（MPIC）等，可参阅有关专著。49（四）尺寸排阻色谱法

1．原理尺寸排阻色谱法（sizeexclusionchromatography，SEC），又称凝胶色谱法、凝胶过滤色谱法（gelfiltrationchromatography，GFC）、凝胶渗透色谱法（gelpermeationchromatography，GPC）、空间排阻色谱法它主要用于较大分子的分离。固定相为化学惰性多孔物质—凝胶，它