酶工程第六章 酶、细胞、原生质体固定化

Charter6Immobilizedenzymeandcell第六章酶、细胞、原生质体固定化直接应用酶的不足之处:(1)酶的稳定性差,在温度、pH和无机离子等外界因素的影响下,容易变性失活(2)酶通常在水溶液中与底物反应，反应结束后，即使仍有较高酶活力，也难于回收利用，成本较高，不便连续化生产(3)酶反应后成为杂质与产物混在一起,增加分离纯化的困难对于现代工业来说,酶还不是一种理想的催化剂！怎样才能获得理想的生物催化剂?答案：固定化酶固定化细胞固定化酶与固定化细胞是酶工程研究中的一个广阔领域，前景光明第一节酶的固定化

固定化酶是指将水溶性的酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的酶。反应后的酶可以回收重复使用。一、固定化酶的定义什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术固定化酶的优点①极易将固定化酶与底物、产物分开;②可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应;③在大多数情况下,能够提高酶的稳定性;④酶反应过程能够加以严格控制;⑤产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺;⑥较游离酶更适合于多酶反应;⑦可以增加产物的收率,提高产物的质量;⑧酶的使用效率提高,成本降低。二、固定化酶的制备原则根据应用目的、应用环境，选择固定化的方法，都要遵循以下基本原则：①必须注意维持酶的催化活性及专一性。②固定化应该有利于生产自动化、连续化。③固定化酶应有最小的空间位阻④酶与载体必须结合牢固,从而使固定化酶能回收贮藏,利于反复使用。⑤固定化酶应有最大的稳定性,所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。⑥固定化酶成本要低,以利于工业使用。

1、吸附法2、包埋法3、结合法4、交联法酶固定化方法1、吸附法用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法。固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等;(1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用;(2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落.吸附法2、包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中的固定化方法多孔载体琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚酰胺、火棉胶等(1)凝胶包埋法天然凝胶：条件温和，操作简便，对酶活影响小，强度较差合成凝胶：强度高，耐温度、pH值变化强，因需聚合反应而使部分酶变性失活适用性：不适用于底物或产物分子很大的酶类的固定化

常用的包埋剂如：聚丙烯酰胺凝胶。先把酶与丙烯酰胺单体分散于疏水介质,再进行聚合。

如：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶包埋于丙烯酰胺和丙烯酸中，然后再用羰二亚胺活化载体上的羧基而共价偶联固定。(2)半透膜包埋法半透膜：聚酰胺膜、火棉膜等，孔径几埃至几十埃，比酶分子直径小适用性：底物和产物都是小分子物质的酶微胶囊：直径一般只有几微米至几百微米。制备酶及亲水性单体溶于水疏水性单体溶于有机溶剂混合乳化剂乳化酶液分散成小水滴亲水性、疏水性单体在两相界面上聚合成半透膜，将酶包埋半透膜酶液滴3、结合法选择适宜的载体,使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法(1)离子键结合法载体:DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等不溶于水的离子交换剂操作:将酶液与载体混合搅拌几个小时;或将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱;活力损失少,结合力较弱，条件(pH值和离子强度)改变时,酶易脱落(2)共价键结合法是载体结合法中报道最多的方法;载体分类:纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质等;载体活化:借助某种方法，在载体上引进某一能够与酶分子上某一基团反应的活泼基团优点:结合很牢固，酶可连续使用较长时间缺点:操作复杂，共价结合可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活性4、交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构。特点：此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是不使用载体。双功能试剂：戊二醛、己二胺、双偶氮苯等第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶戊二醛:优点：结合牢固，可以长时间使用。缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团被交联，酶活损失大，颗粒较小，使用不便。固定化酶方法的优缺点比较特性物理吸附法离子结合法包埋法共价结合交联法制备易易易难难结合力中弱强强强酶活力高高高中中底物专一性无变化无变化无变化有变化有变化再生可能可能不可能不可能不可能固定化费用低低中中高二、固定化酶的特性稳定性比游离酶的好（1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度。A固定化酶B游离酶（2）保存稳定性好，保存时间延长。（3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。（4）对变性剂(如尿素、有机溶剂、盐酸胍等)的耐受性提高，仍保留较高的酶活力。最适温度一般与游离酶差不多。最适温度(续)例外用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，比游离酶高5-10℃;以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高5-15℃汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为80℃，比固定化前提高了30℃同一种酶;用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能不同不同方法和载体固定化氨基酰化酶的最适温度载体

方法最适温度(℃）游离60DEAE-葡聚糖凝胶离子键结合法72DEAE-纤维素离子键结合法67DEAE-葡聚糖凝胶烷基化法<60最适pH值酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶—pH曲线常发生偏移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响。pH对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响带负电荷的载体，固定化酶最适pH值比游离酶的高(1)载体的带电性质对最适pH的影响带正电荷的载体，固定化酶最适pH值比游离酶的低不带电荷的载体，固定化酶最适pH值一般不变(2)产物酸碱性对最适pH值的影响酸性:固定化酶的最适pH值比游离酶的高碱性:固定化酶的最适pH值比游离酶的低中性:固定化酶的最适pH值一般不变原因:载体障碍产物的扩散底物的特异性与底物分子量的大小有关;作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基酰化酶、葡聚糖氧化酶等;既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酶蛋白的作用仅为游离酶的3%左右原因:载体的空间位阻作用三、固定化酶的应用一、在工业生产上的应用

1.氨基酰化酶（Aminoacylase）

世界上第一种工业化生产的固定化酶RCHCOOHHNOOCCH3+H2ORCHCOOHNH2+CH3COOHL-乙酰氨基酸L-氨基酸

2.葡萄糖异构酶(glucoseisomerase)

世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。(3)天冬氨酸酶1973年，日本，聚丙烯酰胺凝胶为载体固定化具高活力天冬氨酸酶的大肠杆菌，包埋法，将延胡索酸转化成L-天冬氨酸。1978年，角叉菜胶固定化纯酶，离子键结合法。(4)青霉素酰化酶1973年，催化青霉素或头孢菌素水解6-氨基青霉烷酸(6-APA）或7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA),也可催化感6-APA或7-ACA+羧酸衍生物合成不同侧链基团的青霉素或头孢霉素;(5)延胡索酸酶1974年，由延胡索酸制L-苹果酸，聚丙烯酰胺包埋法，产氨短杆菌。1977年，由延胡索酸制L-苹果酸，角叉菜胶包埋法，黄色短杆菌(6)ß-半乳糖苷酶1977年，水解乳中的乳糖生产低乳糖奶(7)天门冬氨酸-ß-脱羧酶1982年，天门冬氨酸生产L-丙氨酸。假单孢菌，凝胶包埋二、在酶传感器方面的应用酶传感器

用固定化酶制成探头，再与适当的能量转换器密切结合而组成的传感装置，属于生物传感器的一种。优点：①既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的灵敏度；②酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。

用途:

临床诊断、工业发酵过程控制、环境监测。SensitiveandspecificRapidSimpleBiosensor酶电极:应用最广泛。酶电极工作原理示意图酶电极主要由固定化酶膜和电极组成。固定化酶膜：是酶经固定化后形成的一种生物敏感膜结构，能选择性地“识别”并催化被检测物质发生化学反应；电极：把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。

葡萄糖氧化酶电极Updike等用聚丙烯酰胺凝胶包埋法将葡萄糖氧化酶固定化，制成厚度为20-50µm的酶膜，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器——葡萄糖氧化酶电极。基本结构：酶膜+高分子薄膜(聚四氟己烯等)+氧电极图6-1葡萄糖氧化酶电极示意图D－葡萄糖＋O2 D－葡萄糖酸＋H2O2

根据反应中消耗的O2量，可以用氧电极来测定葡萄糖的含量。葡萄糖氧化酶手掌型葡萄糖(glucose)分析仪SBA-70型血糖自动分析仪青霉素酶电极酶膜:青霉素酶+聚丙烯酰胺凝胶(或光交联树脂)电极:pH电极结合:酶膜紧贴在玻璃(pH)电极上反应:青霉素+H2O青霉烷酸+H+青霉素酶表6-1一些常用的酶电极固定化酶今后发展与应用的重要方向研究新型载体，进一步对具有适宜生物相容性及亲水性的天然高分子载体进行不断挖掘和探究；探索并开发有机介质中酶的固定化方法；建立多酶固定化系统并广泛应用于工业化生产中。第二节细胞固定化概念固定化细胞就是被限制自由移动的细胞,即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内,但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力;固定化细胞的研究和应用始于20世纪70年代,后来居上,实际应用超过固定化酶。优点省去了酶的分离过程；增强酶的稳定性；有利于产品的分离纯化；对于多酶反应体系，无需辅因子再生。固定化细胞的优点一、细胞固定化的方法固定化酶和固定化细胞都是以酶的应用为目的,其制备方法和应用方法也基本相同1、吸附法利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定的方法。吸附剂：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。优点：操作简便易行，不太影响细胞的生长、繁殖和代谢缺点：吸附力较弱，细胞易脱落细胞载体用途备注酵母多孔陶瓷或塑料酒精、啤酒生产pH3~5活性污泥硅藻土、多孔玻璃、陶瓷或塑料有机物废水处理沉积吸附霉菌多孔塑料、金属丝网有机酸和酶生产菌丝体植物细胞中空纤维、泡沫塑料生产色素、香精、药物和酶等动物细胞容器壁、微载体或中空纤维外壁生产功能蛋白实例2、包埋法将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法。有凝胶包埋法和半透膜包埋法之分，前者常用载体操作过程成型条件特点或注意事项琼脂水溶液冷却至48~55ºC加入细胞悬浮液迅速混匀趁热分散在致冷的甲苯或四氯乙烯液中机械强度较差、氧气、底物、产物扩散较困难海藻酸钙水溶液

灭菌冷却后与细胞或孢子悬浮液混匀用注射器或滴管滴入氯化钙溶液操作简便，条件温和对细胞无毒。磷酸盐会破坏凝胶结构角叉菜胶水溶液

灭菌冷却至35~50ºC与细胞悬浮液混匀趁热滴到预冷的氯化钾溶液中具备一定的机械强度,操作简便，通透性能较好，对细胞无毒害载体操作过程成型条件特点或注意事项明胶悬浮液加热溶化、灭菌，冷却至35ºC以上，与细胞悬浮液混匀冷却凝集后做成所需的形状机械强度不够时用戊二醛交联剂交联丙烯酰胺+甲叉丙烯酰胺与细胞悬浮液混匀加入过硫酸钙和四甲基乙二胺混合后静置聚合机械强度高，丙烯酰胺单体对细胞有一定毒害，尽量缩短聚合时间光交联树脂预聚物+光敏剂+水加热至50ºC溶解与细胞悬浮液混匀摊成薄片，用紫外光照射3min左右，无菌条件下切成块机械强度高，固定化快，对细胞生长等无明显影响二、微生物细胞固定化(1)保持了细胞完整结构和天然状态,稳定性好;(2)保持了原酶系,按原代谢途径进行新陈代谢;(3)发酵稳定性好;(4)细胞密度提高,提高产率;(5)提高工