DNA复制、转录和翻译

第四章DNA的复制、转录和翻译

DNA复制

(replication)

——

由亲代DNA合成两个相同的子代DNA的过程（DNA指导的DNA生物合成）。

复制亲代DNA子代DNA一、复制可能的几种方式全保留式半保留式混合式DNA复制方式——密度梯度实验

含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液

第一代继续培养于普通培养液第二代梯度离心结果

－半保留复制

(semi-conservativereplication)

当DNA进行复制时，双螺旋结构解开成两条单链，各自作为模板合成与之互补的新链。在子代DNA双链中，一条是来自于亲代，另一条完全重新合成。这种复制方式称为半保留复制

半保留复制

按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义

遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。二、DNA半保留复制所需条件：模板(template):

解开成单链的DNA母链；底物（substrate)

:

4种脱氧核苷三磷酸（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）；聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶（DDDP），简写为DNA-pol；如何获得单链DNA模板？？多种蛋白质参与（以大肠杆菌为例）解链酶（helicase）；单链结合蛋白（single－strandDNAbindingprotein，SSB）；DNA拓扑异构酶（DNAtopoisomerase

）解链酶（helicase)

——

利用

ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。单链DNA结合蛋白（SSB）

SSBDnaBDnaC解链方向拓扑异构酶解除超螺旋DNA线性双螺旋从中间解链上下都过度拧紧超螺旋进一步解链就更加困难拓扑异构酶I切开超螺旋的单链，再连接成双链。无需ATP。拓扑异构酶II切开超螺旋的双链，解除超螺旋，再连接成双链。参与复制全过程DNA聚合酶的分类1、原核生物的DNA聚合酶：DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢDNA聚合酶——DNA生物合成

※大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（E.ColiDNApolymeraseⅠ

）和Klenow片段

※大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ－复制中DNA链延伸

※大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ（一）DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是单一多肽链的多功能酶，分子量为102kD，它具有3种酶活性：①5

→3

DNA聚合酶活性。②3

→5

核酸外切酶活性。③5

→3

核酸外切酶活性。（DNA合成）（校对）（切除RNA引物和突变序列）

5

至3

的聚合活性

dTTP3'(dNMP)n+dNTP

(dNMP)

n+1+ppi3'

ATGCAATTGC5'||||5

TACGppi

TDNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase，DDDP）

聚合反应的特点：1、聚合反应具有方向性:5

3

2、DNA聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的3-OH逐个添加脱氧核苷酸，使核苷酸链不断延长。5’AGCTTCAGGATA

3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAGCGAC5’3

5

外切酶活性

5

3

外切酶活性?切除引物或突变的DNA片段辨认错配的碱基对，将其水解－校对

核酸外切酶活性

真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

后随链合成先导链合成DNA修复起校读、修复和填补缺口的作用？线粒体DNA复制DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

复制的保真性(fidelity)

DNA聚合酶对模板的依赖性，是子链与母链能准确配对的保证。复制过程中，复制的保真性至少依赖三种机制：1、遵守严格的碱基配对规律2、聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能3、复制出错时DNA-pol的及时校读功能DNA复制中为何需RNA引物？DNA聚合酶没有从头催化2个游离的脱氧核苷三磷酸聚合的能力；只能在3’-OH端与按碱基配对的dNTP进行反应，生成磷酸二酯键；引物提供游离的3’-OH末端；引物酶和引发体引物酶(

primase

)在模板的复制起始部位催化NTP的聚合,形成短片段的RNA。这一小段RNA作为复制的引物（primer），提供3

-OH末端，使DNA-pol能够催化dNTP聚合。依赖DNA的RNA聚合酶引物酶与其他和复制有关的蛋白质形成的复合物。引发体（primosome）DNA连接酶(DNAligase

)连接DNA链3

-OH末端和相邻DNA链5

-P末端，使二者生成磷酸酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。ATPDNA连接酶在DNA修复、重组、剪接中也起连接缺口的作用。OHPDNA复制过程G1G2SM哺乳动物的细胞周期DNA合成(synthesis)期人为分成：起始、延长、终止三个阶段一、复制的起始需要解决两个问题：1、DNA解开成单链，提供模板2、生成引物，提供3-OH末端

相关的几个概念：1、复制起始点（E.coli-oriC）GATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATTACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串联重复序列反向重复序列5

3

5

3

复制时DNA双链解开分成二股单链‚新链沿着张开的二股单链生成，复制中形成的这种Y字形的结构称为复制叉。2、复制叉（replicationfork）3

5

5

3

新链3

5

3

5

亲代DNA复制方向原核生物例如E.coli，是从固定的复制起始点开始，同时向两个方向进行复制

称为双向复制（bidirectionalreplication）

3、双向复制DnaA蛋白辨认起始点,形成起始复合物DnaB蛋白解螺旋DnaC蛋白协助DnaB在多种蛋白质参与下，DNA解开成单链HU蛋白促进起始SSB维持单链稳定引物合成DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶OHSSB3

5

3

5

真核生物的染色体庞大、复杂，有多个复制起始点，同时进行多个DNA片段的复制。两个起始点之间的DNA片段，称为一个复制子（replicon）。真核生物也是双向复制。二、复制的延长DNA聚合酶催化游离的脱氧核苷酸结合到新链3’末端，使其不断延长。5’3’5’DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol（一）复制延长的过程dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTP领头链(leadingstrand

)

顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行的，所得到一条连续片段的子链。5’3’3

5

3

5

解链方向

（二）复制的半不连续性3

5

3

5

解链方向复制方向与解链方向相反，须等待解开足够长度的模板链才能继续复制，所得到一条由不连续片段组成的子链。随从链

(

laggingstrand

)

冈崎片段（Okazakifragment）

3’5’3’3’5’三、复制的终止原核生物的复制终止1.多为环状DNA分子，双向复制的复制片段在复制的终止点（ter）处汇合。5`5`5`RNA酶OHP5`DNA聚合酶dNTP5`5`PATPADP+Pi5`5`DNA连接酶2.随从链上不连续性片段的连接真核生物的复制终止1，染色体DNA呈线状，复制在末端停止5`5`5`5`水解、聚合、连接5`5`5`5`

2，连接不连续片段端粒（

telomere）真核生物染色体线性DNA分子末端的特殊结构1、结构特点：1）由末端单链DNA序列和蛋白质构成2）末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。2、功能1）维持染色体的稳定性2）维持DNA复制的完整性TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒酶（

telomerase）1一种RNA-蛋白质的复合物

2一种特殊的逆转录酶,能依赖自身的RNA为模板逆转录合成端粒DNA

特点：功能：

复制终止时，染色体线性DNA末端确有可能缩短，但通过端粒酶的作用，可以补偿这种由除去引物引起的末端缩短。telomerase端粒酶与药物hTR和hTERT核酶逆转录酶抑制剂3-叠氮胸苷（AZT）四、其他复制方式滚环复制rollingcirclereplicationDNA复制

概念:半保留复制,半不连续复制(前导链,后随链),冈崎片段

DNA复制的酶学

DNA聚合酶(DDDP,多功能酶)

5’-3’聚合酶活性---依赖模板的新链延伸3’-5’外切酶活性---校读5’-3’外切酶活性---切除引物与突变片段DNA复制的酶学

起始阶段---获得单链模板解螺旋酶,拓扑异构酶,单链结合蛋白等端粒（telomere）与端粒酶（telomerase）端粒功能

1）维持染色体的稳定性

2）维持DNA复制的完整性第四节反转录反转录

(reversetranscription)

以RNA为模板，合成与其互补的DNA的过程,也称逆转录

。RNADNA反转录酶①RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP）。②核糖核酸酶H活性（RNaseH）。③DNA聚合酶活性（DDDP）。反转录酶的作用－合成cDNA：反转录酶（reversetranscriptase）

是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为反转录过程。反转录酶是多功能酶。5

3

3

5

RNA(用表示)RNA-DNA杂化分子3

5

RNase（核酸酶H活性)

DDDP（DNA聚合酶活性）

4种dNTP

RDDP（反转录酶）引物、4种dNTP病毒双链DNA用表示）（cDNA第二链(complementaryDNA，cDNA)与病毒RNA互补的DNA(用表示)5

3

3

5

5

3

5

3

反转录酶的作用转录(

transcription

)生物体以DNA为模板合成RNA的过程转录RNADNA

转

录

的条件：原料

:

4种NTP(ATP,

UTP,

GTP,CTP)模板

:单链DNA

酶

:RNA聚合酶其他蛋白质因子复制与转录的异同?？相同点模板：DNA

原料：核苷三磷酸

合成方向：5′→3′方向依赖DNA的聚合酶遵守碱基互补配对规律产物为多聚核苷酸链不同点

复制转录模板两股链均作为模板一条模板链原料dNTPNTP

聚合酶DNA聚合酶RNA聚合酶产物子代DNA双链mRNA;tRNA;rRNA…

配对A-T；G-CA-U；T-A；G-C★

引物需RNA引物--------★方式半保留复制不对称转录

DNA模板

5

3

3

5

模板链编码链编码链模板链（templatestrand）

codingstrand不对称转录

（asymmetrictranscription）*

在DNA分子双链上某一区段，一股链可转录，另一股链不转录；*

模板链并非永远在同一单链上。

转录的忠实性/进行性

固定的起点和终点

严格遵守碱基互补

保真性低于复制104－106转录起始RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域;DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板需解决两个问题：

模板和RNA聚合酶的辨认、结合5

3

3

5

结构基因调控序列RNA-pol——启动子（promoter)RNA聚合酶识别,结合并起始转录的一段高度保守性DNA序列，称为

36512决定哪些基因被转录

150618催化功能

155613结合DNA模板

70263辨认起始点亚基分子量功能

原核生物的RNA聚合酶

核心酶

coreenzyme全酶

holoenzyme

保守序列（一致性序列）开始转录TTGACAAACTGT-35

区(Pribnowbox)结合部位，影响启动子复合物形成；TATAATPuATATTAPy-10

区1-30-5010-10-40-205

3

3

5

识别部位，还决定启动子强度；原核生物启动子（Sextama框）间隔区

原核生物的转录起始2DNA双链解开,形成转录空泡1RNA聚合酶全酶(2)与模板结合

3

在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应–

5’-pppGpN

–OH+ppiRNApol-DNA-pppGpN-OH

pppGNTPpppGpN-OHppi起始复合物:5’-pppG-OH+

NTP5

3

DNA原核生物转录过程中的现象核糖体RNARNA聚合酶

转录终止------RNA聚合酶在DNA模板上停止前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来

原核生物的转录终止子（terminator）1、依赖ρ因子（Rho)

的转录终止2、不依赖ρ因子的转录终止

DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT

DNA或UUUU˙

˙

˙

˙

˙

˙CAAUCAA茎环结构RNA5’pppG53

35茎环结构使转录终止：1，使RNA聚合酶变构2，使转录复合物趋于解离，RNA产物释放RNA-pol

真核生物的RNA聚合酶

种类

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

对鹅膏蕈碱的反应45S-rRNA

前体hnRNA，snRNA

5S-rRNAtRNA、snRNA耐受

极敏感中度敏感转录产物启动子一种多种下游启动子

真核生物的转录起始

也需要RNA聚合酶辨认、结合转录起点的顺式作用元件，生成起始复合物。顺式作用元件

------

真核生物结构基因上游的调控区存在的相似或一致性的DNA序列。

-GCGC---CAAT---TATA转录起始

TATA盒（-30～-25）

CAAT盒(-75)

GC盒(-90)基因

增强子(enhancer)增强转录效率顺式作用元件RNA聚合酶II启动子DTATAABDNATATAFE反式作用因子

------

直接或间接辨认、结合顺式作用元件并影响其功能的蛋白质。

RNA聚合酶与模板DNA的结合需一系列转录因子(TF)的参与。RNA聚合酶真核生物的转录终止——和转录后加工密切相关5’------AAUAAA-5’------AAUAAA--Poly(A)mRNA核酸酶-GUGUGUGAATAAAGTGTGTG转录终止的修饰点5’5’3’3’RNA-pol

蛋白质的生物合成

——翻译(p182)

翻译（translation）是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸的三联体遗传密码翻译成氨基酸序列，合成多肽链的过程，是基因表达的最终目的。

模板：mRNA

原料：20种编码氨基酸氨基酸运载体：tRNA

场所：核蛋白体酶：氨基酰-tRNA合成酶、转肽酶蛋白质因子：起始因子（initiationfactors,IF;eIF）延长因子（elongationfactors,EF）释放因子（releasefactors,RF）核蛋白体释放因子（ribosomalreleasefactors,RRF）蛋白质生物合成体系mRNA是翻译的直接模板

开放阅读框架（openreadingframe,ORF）

mRNA从5’→3’方向，由起始密码子到终止密码子的序列，称为一个开放阅读框架。

遗传密码（geneticcodon）

开放阅读框架内每3个碱基组成的三联体，决定一个氨基酸，称为遗传密码。

遗传密码的特点（一）连续性（commaless）（二）方向性（sideness）（三）简并性（degeneracy）（三）摆动性（wobble）（四）通用性（universal）（五）偏爱性（biasorpreference）AUGUGAUAAUAG密码子反密码子密码的摆动性

mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子相互辨认，大多数情况下是遵从碱基配对规律的。但也可出现不严格的配对，这种现象就是遗传密码的摆动性。开放阅读框架OpenReadingFrame-GACUACAAGGUAUGCCCUUGCUUCACAUGUAAACGC-mRNA翻译起始点5’非翻译区3’非翻译区起始密码AUG终止密码UAA、UAG、UGAmRNA上从翻译起始点开始，三个碱基编码一个氨基酸。从起始AUG密码到终止密码（UAA）前的序列，代表整个一条多肽链的氨基酸信息，称为“开放阅读框架”（ORF）。这些碱基的替换、插入、缺失，都可能造成密码的混乱和氨基酸序列的改变，称为“frameshift，或者框移”。核蛋白体是肽链合成的场所

核蛋白体由大、小亚基组成，每个亚基含有不同的蛋白质和rRNA，原核生物和真核生物又各有不同。30S60S40S50S70S80S肽链合成的“装配机”－核蛋白体大亚基

转肽酶与GTP酶活性小亚基

mRNA与tRNA结合的识别SD序列（Shine-Dalgarno)

原核生物特有的、位于mRNA上起始密码子上游的一段富含嘌呤（AGGA)碱基的短序列，是mRNA与核糖体小亚基结合位点，直接影响翻译效率，又称为核蛋白体结合位点（ribosomalbindingsite，RBS）。密码子反密码子氨基酰-tRNA合成酶－－氨基酰-tRNAThrTyr蛋白质因子：起始因子（initiationfactors,IF;eIF）延长因子（elongationfactors,EF）释放因子（releasefactors,RF）小亚基大亚基mRNA5’3’氯霉素：作用于大亚基，阻断延伸链霉素和卡那霉素：作用于小亚基，使构象改变，引起读码错误S四环素：抑制氨基酰tRNA与核蛋白体的结合IF2干扰素：诱导eIF2磷酸化。蛋白质生物合成的阻断剂

翻译后加工翻译后加工（post-translationalproces