免疫比浊检验技术原理与进展

免疫比浊分析技术原理与进展桂林英美特生物技术研究所一、免疫学基本原理二、免疫沉淀三、免疫比浊技术原理免疫比浊检验技术原理与进展一、免疫学基本原理1、抗原与抗体2、抗原抗体的结合——免疫学反应3、免疫学反应的检测技术1、抗原与抗体抗原（Antigen,Ag）是刺激机体产生免疫应答的物质。

“应”是指抗原刺激机体产生免疫应答产物--抗体或免疫效应细胞“答”是指相应抗原与免疫应答产物结合并将其排除体外）抗原的免疫原性和免疫反应性完全抗原与半抗原抗原表位与抗原结合价位1、抗原与抗体1、抗原与抗体免疫原性免疫原性（immunogenecity）是指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答（产生特异性抗体及免疫效应细胞）的性质。AgTB致敏T细胞活化浆细胞抗体免疫原性示意图1、抗原与抗体免疫反应性：是指抗原分子与免疫应答产物（抗体或免疫效应细胞）发生特异性结合的性质。AgTB致敏T细胞浆细胞

抗原性（免疫反应性）示意图抗体1、抗原与抗体完全抗原（completeantigen)具有免疫原性和抗原性的物质。半抗原（hapten，又称不完全抗原incompleteantigen）无免疫原性，只有抗原性的物质。载体（carrier）赋予半抗原以免疫原性的蛋白质。半抗原+蛋白质（载体）＝完全抗原。半抗原

+载体抗体BTh完全抗原BBBTh半抗原—载体效应示意图半抗原+蛋白质（载体）＝完全抗原1、抗原与抗体抗原决定簇：抗原分子存在的能TCR/BCR或抗体Fab片段特异性结合的特殊化学基团，是免疫应答特异性的物质基础。构象决定簇：构象决定簇（conformationaldeterminant）由空间构象形成的决定簇，序列上不连续。顺序决定簇：顺序决定簇（sequencedeterminant），又称线性决定簇（lineardeterminant），序列相连续的氨基酸肽片段构成的决定簇。抗原结合价：抗原结合价（antigenicvalence）是指能够与抗体分子结合的决定簇数目。1、抗原与抗体1、抗原与抗体抗原表位的性质、数目、位置、空间排列和立体构象决定着抗原-抗体反应的高度特异性。1、抗原与抗体共同表位（commonepitope）指不同抗原之间含有的相同或相似的抗原表位。交叉反应（cross-reaction）指抗体或致敏淋巴细胞对具有相同或相似表位的不同抗原均具有的反应（交叉结合）。1、抗原与抗体抗体（antibody,Ab）功能性概念是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。抗体主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。

免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）结构性概念具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。

抗体一定是球蛋白，球蛋白未必是抗体

1、抗原与抗体抗体的分子结构1、抗原与抗体“Y”型，四肽链重链

（5种:、

、、、）

轻链（2种:

、）可变区

（V区）

超变区（又称CDR互补决定区）

骨架区:FR恒定区（C区）铰链区1、抗原与抗体根据重链抗原性的不同，免疫球蛋白可以分为5类：IgG—γ(gamma)IgA—

α(alpha)IgM—

μ(mu)IgD—

δ(delta)IgE—

ε(epsilon)1、抗原与抗体根据轻链C区抗原性不同，免疫球蛋白可分为2型)

κ(kappa)型

λ(lambda)型轻链存在于各类免疫球蛋白中同一个免疫球蛋白分子中的轻链同型1、抗原与抗体抗体的生物学功能——特异性结合抗原超变区－表位静电力、氢键、范德华力可逆影响因素：PH、温度、电解质

结合基础2、抗原抗体的结合——免疫学反应抗原抗体反应的原理抗原与抗体能够特异性结合是基于两种分子间的结构互补性与亲和性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的。抗原抗体反应可分为两个阶段。第一为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。第二为可见反应阶段，抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、pH、温度、补体）的影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集、沉淀、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。抗原抗体的结合使电荷减少或消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。四种分子间引力（电荷引力、范登华引力、氢键结合力和疏水作用）参与并促进抗原抗体间的特异性结合。2、抗原抗体的结合——免疫学反应典型的抗原抗体结合反应特异性识别形成抗原抗体复合物2、抗原抗体的结合——免疫学反应抗原抗体反应的特点特异性按比例可逆性2、抗原抗体的结合——免疫学反应2、抗原抗体的结合——免疫学反应影响抗原抗体反应的因素电解质（离子强度）：抗原与抗体发生特异性结合后，虽由亲水胶体变为疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现可见反应。为了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85％氯化钠或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释液。由于氯化钠在水溶液中解离成Na+和C1－，可分别中和胶体粒子上的电荷，使胶体粒子的电势下降。当电势降至临界电势（12～15mV）以下时，则能促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。酸碱度（pH）：抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行。蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应一般在pH为6～8进行。PH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质，例如pH达到或接近抗原的等电点时，即使无相应抗体存在，也会引起颗粒性抗原非特异性的凝集，造成假阳性反应。温度：在一定范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。但若温度高于56℃时，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏；在40℃时，结合速度慢，但结合牢固，更易于观察。常用的抗原抗体反应温度为37℃。每种试验都有其独特的最适反应温度，例如冷凝集素在4左右与红细胞结合最好，20℃以上反而解离。其它：适当振荡也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。3、免疫学检测技术凝集与沉淀比浊电位、微天平放射性核素标记酶标记、荧光标记和胶体金标记化学发光物标记或偶联化学发光反应

非标记免疫检测技术标记免疫检测技术二、免疫沉淀凝集：细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为凝集反应（agglutination）是最经典的免疫学检测技术。

二、免疫沉淀免疫沉淀反应:(precipitation)

可溶性抗原与相应抗体，在适宜条件下发生结合，出现的沉淀现象。免疫沉淀液体内沉淀反应凝胶内沉淀反应免疫电泳技术免疫浊度技术絮状沉淀试验环状沉淀试验单向扩散试验双向扩散试验试管法平板法免疫电泳对流免疫电泳火箭免疫电泳免疫固定电泳透射免疫比浊turbidimetermeasure散射免疫比浊nephelomitermeasure1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀释加入抗血清各管抗体量不变振摇混匀、37℃孵育沉淀量不同试管内絮状沉淀试验轻摇絮状沉示意图淀AgAbAgAbAg凝胶内沉淀——试管法单向琼脂扩散试验凝胶内沉淀试验——平板法标准品抗原浓度测定不同病人抗原浓度测定原理

将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测抗原在凝胶中自由扩散，与相应抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。

凝胶内沉淀——双向琼脂扩散原理示意图