基因工程分子生物学第三章载体

第三章载体

第一节载体的概念一、基因复制的基本单位——复制子（replicon）

TheunitofDNAinwhichanindividualactofreplicationoccursiscalledthereplicon.Eachreplicon"fires"onceandonlyonceineachcellcycle.Therepliconisdefinedbyitspossessionofthecontrolelementsneededforreplication.Ithasanoriginatwhichreplicationisinitiated.Itmayalsohaveaterminusatwhichreplicationstops(Jacob,Brenner,andCuzin,1963).某一复制行为发生所在的DNA单位称为复制子(replicon)。每个复制子在每个细胞周期中只“引发”一次。复制子是由它具有复制作用所必需的各种控制元件而定义的。它有一个复制启动的起点(origin)，可能还有一个复制终止的终点(terminus)。

Anysequenceattachedtoanorigin—or,moreprecisely,notseparatedfromanoriginbyaterminus—isreplicatedaspartofthatreplicon.Theoriginisacis-actingsite,abletoaffectonlythatmoleculeofDNAonwhichitresides

连在起点后的任何序列(或更确切地说，没有被终点从起点上分隔开的序列)均作为这个复制子的一部分进行复制。起点是一个顺式作用部位，只能对与它相连的DNA分子起作用。

Agenomeinaprokaryoticcellconstitutesasinglereplicon;原核细胞内的一个基因组由单一复制子构成。

Bacteriamaycontainadditionalgeneticinformationintheformofplasmids.

AplasmidisanautonomouscircularDNAgenomethatconstitutesaseparatereplicon.Aplasmidrepliconmayshowsinglecopycontrol,whichmeansthatitreplicatesonceeverytimethebacterialchromosomereplicates.Oritmaybeundermulticopycontrol,whenitispresentinagreaternumberofcopiesthanthebacterialchromosome.细菌可含有以质粒形式存在的附加遗传信息。质粒是一种自主的环状DNA基因组，它含有一个与染色体分离的复制子。质粒可以是单拷贝控制（singlecopycontrol）的，即，每次细菌染色体复制时它复制一次。也可以是多拷贝控制（singlecopycontrol）之下的，相对于细菌染色体，它存在大量拷贝。EachphageorvirusDNAalsoconstitutesareplicon,abletoinitiatemanytimesduringaninfectiouscycle.Perhapsabetterwaytoviewtheprokaryoticreplicon,therefore,istoreversethedefinition:anyDNAmoleculethatcontainsanorigincanbereplicatedautonomouslyinthecell.每个噬菌体或病毒也包含一个复制子，但每次侵染周期能够起始多次复制。所以，对于原核复制子来说：任何含有一个复制起点的DNA分子都可以在细胞内自主复制。Eacheukaryoticchromosomecontainsalargenumberofreplicons.每个真核染色体包含大量复制子。（Theoriginalformulationofthereplicon[inprokaryotes]vieweditasaunitpossessingboththeorigin

andthegenecodingfortheregulatorprotein.Now,however,"replicon"isusuallyappliedtoeukaryoticchromosomestodescribeaunitofreplicationthatcontainsanorigin;trans-actingregulatorprotein(s)maybecodedelsewhere.)起点具有什么特殊序列呢？如何为复制装置中的一些特殊蛋白所识别呢？二、大肠杆菌的复制起点的克隆标记获救方法的原理是从某一质粒取得带有抗药性基因(例如APR)可是不能自主复制的限制酶切片段，用同一种酶处理大肠杆菌的染色体DNA，经DNA连接酶处理后转化大肠杆菌，选择抗氨苄青霉素的转化子，这些细菌中含有由复制起点片段以及APR片段构成的质粒。pYT10便是这样一个质粒.CloningofE.colioriCusinggeneticselectionforampicilinresistanceandreplication.Ampicilin-sensitive(Amps)E.coliweretransformedwith(A)acollectionofcircularized

EcoRIfragmentsofE.coliDNA(butnoampicilin-resistancegeneiscontainedonanyofthefragments),with(B)acircularizedEcoRIfragmentcontaininganampicilin-resistancegene(butthisfragmentdoesnotcontainanoriginofreplication),orwith(C)acollectionofcircularizedmoleculesformedbyjoiningtheEcoRIfragmentcontainingtheampicilin-resistancegenetoeachoftheE.coli

EcoRIfragments(oneofwhichcontainsoriC).(A)and(B)donotgiverisetoampicilin-resistantcolonies.(C)givesrisetoafewampicilin-resistant(Ampr)colonies,andeachofthecellsineachofthesecoloniescontainsanidenticalplasmid:theplasmidsallhavethe6.8kbEcoRIfragmentcontainingtheampicilin-resistancegeneanda9.0kbEcoRIfragmentcontainingoriC.复制起始点的必要区域具有大肠杆菌染色体DNA复制起点的质粒pSY211经多种限制性内切酶处理，可以得到大小不一而都能复制的质粒，它们的共同部分必然都包括复制起点，它们的长度相当于422bp。这里面是否还包括不必要的部分呢？为了解答这一向题，把pSY211质粒的这一422bp片段切下，和质粒pBR322连接起来成为质粒ptso，pBR322的一个特性是它的复制依赖于宿主细胞的DNA聚合酶I，因此在一个温度敏感的聚合酶突变型polAts（polA：DNA聚合酶I的编码基因,ts:temperaturesensitive42℃下不可复制）E.coli中这一嵌合质粒得以在37℃和42℃中复制，但是如果这一嵌合质粒中的染色体复制起点丧失了功能，那么它便只能在37℃中复制，在42℃中便将由于不能复制而消失。pBR322带有抗药性基因APR，所以只要在42℃中测定细菌能否在含有氨苄青霉素的培养基上生长，便可以知道染色体复制起点的功能是否丧失。ORIGINEscherichiacolistrainATCC25922originofreplicationoriC,completesequence.1

ggatcctgggtattaaaaagaagatctatt

tatttagaga

tctgttctat

tgtgatctct

61

tattaggatcgcactgccct

gtggataacaaggatccggcttttaagatcaacaacctgg121aaaggatcattaactgtgaatgatcggtgatcctggaccgtataagctgggatcagaatg181aggggttata

cacaactcaaaaactgaacaacagttgttc

tttggataactaccggttga241tccaagcttcctgacagagttatccac

agtagatcgcacgatctgtatac//通过缺失分析已经证明，E.coli双向复制原点oriC至少包括245bp(+23~+267)，位于gidA基因和16KDa基因之间，在E.coliK12株的遗传图上位于84分钟。FIG.Consensussequenceoftheminimaloriginofthebacterialchromosome.Theconsensussequenceisderivedfromsixbacterialoriginsequences,thoseofE.coli(2,3),S.typhimurium(4),Enterobacteraerogenes(5),K.pneumoniae(5),Erwiniacarotovora(6),andV.harveyi.Thealignmentofthesixsequencesissuchthattheleastnumberofchangesareintroducedintotheconsensussequence.Thetwobasesinserted(atpositions239and240)anddeleted(atpositions246and247)arecountedastworatherthanfourchangesforcalculationsinthetext.Intheconsensussequence,alargecapitallettermeansthatthesamenucleotideisfoundinallsixorigins;asmallcapitallettermeansthenucleotideispresentinfiveofthesixsequences;alowercaseletterisusedwhenthatnucleotideispresentinthreeorfourofsixbacterialoriginsbutonlytwodifferentnucleotidesarefoundatthatsite;andwherethreeorfourofthefourpossiblenucleotides,ortwodifferentnucleotidesplusadeletion,arefoundatasite,theletternisused.Boldlargecapitalletterslocatepositions149,242,and267,wheresingle-basesubstitutionsproduceanoriC-phenotypeinE.coli(31).Thearrowatposition166representsthefirstribonucleotideofaRNAtranscribedbyRNApolymeraseinvitro(32).Thearrowsendingbetweenpositions71and72andpositions107and108markthemajorRNA-DNAtransitionsites(33).Thedirectionsofthesethreearrowsshowthedirectionoftranscription.Intheindividualoriginsequences,-meansadeletionrelativetotheconsensussequenceispresentand.indicatesthatthenucleotideinthebacterialsequenceisthesameasthenucleotideintheconsensussequence.G-A-T-CsitesareunderlinedintheconsensussequenceandcertainE.colirestrictionsitesarenoted.TheminimaloriginofE.coli(34)isenclosedwithinthebox.ThenumberingofthenucleotidepositionsisthatusedforE.coli(2,3),andtheupperleftendisthe5'end.Thefourrelated9-bprepeats,R1,R2,R3,andR4,areindicatedbythearrows,withthe5'to3'sequencegivenbelowthearrow.三、复制起点的功能R1R2R3R413-merequence(ATrich)FigureSchematicofDNApolymeraseIIIholoenzyme.DNApolymeraseIIIholoenzymecontains10differentsubunits;arrowsidentifyeachofthem.Thethreefunctionalcomponentsoftheholoenzymeareshowntotherightofthediagram[clamp(β),corepolymerase(αεθ),

γcomplex(γδδ’χψ)]Theτ

subunitdimeractsasagluetobindtogethertwocorepolymerasesandoneγcomplextoformthe

PolIII*subassembly(theholoenzymelackingβ)asshowninthediagramatthefarrighttheclamp-loadingcomplexTheclamp-loadingcomplexconsistsofthedelta(δ)(38.7kD)anddelta(δ')prime(36.9kD),chi(χ)(16.6kD)andpsi(ψ)(15.2kD)subunitsandeitherorbothofthegamma(γ)subunit(68.4kD)andthetau(τ)subunit(71.1kD).BoththegammaandtausubunitsareencodedbythednaXgene.Thisgeneistranslatedintwodifferentways.Ifthegeneistranslatedcompletelythenthetau(τ)subunitissynthesized.Iftranslationslipsorframeshiftspartwaythroughthereadingframethenastopcodonisencountered,andthegamma(γ)subunitissynthesized.

Boththegamma(γ)subunitandthetau(τ)subunitare‘motor'ATPases.Thestructuresofmanyofthesesubunitshavenowbeensolvedandtheyarebeginningtorevealhowthedifferentsubunitsinteractandfunctioninthebuildingofareplisomeandinitsongoingfunction.Theδsubunitbindstotheβsubunitand,inconcertwiththeδ'andγsubunitsandwithATP,itcatalysestheopeningoftheβdimertopermitpassageofDNA.

四、载体的概念基因克隆是要把一个外源基因导人寄主细胞，并使它得到扩增。然而，外源基因一般不具有复制起点，不是一个独立的复制子。同时，对于寄主来说它又是外源的，会受到限制。所以一段外源基因进入寄主细胞后，很难生存和繁殖。为了使外源基因能够生存和繁殖，可以将它与寄主内的独立复制子重组在一起，然后导入到寄主细胞。由于它被寄主内的独立复制子的携带和保护而生存和繁殖下来。这种携带和保护外源基因在寄主细胞内生存和复制的独立复制子被称为载体(vector)。作为载体应具备的条件：（1）是一个独立的复制子，有复制起点；（2）有选择遗传标记；（3）具有多种选择的克隆位点。克隆位点为RE位点，作为克隆位点的限制酶位点在一种载体出现的次数最多不超过两次。

第二节质粒载体1946~1947年，Lederberg和Tatum发现，微生物不仅有无性繁殖也有有性繁殖一接合现象,这种性因子被称为F因子。1952年，Lederberg指出，细菌的F因子与高等生物细胞质中染色体外遗传单元极为相似，因此，他正式提出了质粒这一名称。同时，从E.coli细胞中又发现了一种抗菌物质一大肠杆菌素。到1954年才证明，这种抗菌素是由另一类新质粒产生的，包括ColB，ColV，ColE等等。有的能进行接合传递，有的不能进行接合传递。大约在1959~1960年日本学者在研究一批用普通的强效抗菌素治疗菌痢患者时，得到了一项惊人的发现，病源菌痢疾志贺氏菌含有使其同时能抗几种抗菌素的基因，而且这种抗性基因能以和F因子非常相似的方式转移给其他肠道细菌。显然，携带抗性基因的这种转移因子也是一种质粒，当时称为抗药性因子(R因子)。在R因子的DNA基因组上具有为某些酶编码的基因，能对链霉素、氯霉素、磺胺药物等进行修饰而使之钝化。质粒是亚细胞有机体。它的结构比病毒还要简单些，既没有蛋白质外壳，也没有细胞外的生命周期，只能够在寄主细胞内独立地增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。1．质粒的生物学在大肠杆菌的各种菌株中，找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。

F质粒（F:fertility）又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。

R质粒通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子，它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。天然质粒和人工构建的实验室质粒质粒DNAcovalentlyclosedcirclesorCCCDNAopencirclesorOCDNAlinearizedplasmidLinearplasmid

Fig.EffectofintercalationofethidiumbromideonsupercoilingofDNA.Astheamountofintercalatedethidiumbromideincreases,thedoublehelixuntwists,withtheresultthatthesupercoilingdecreasesuntiltheopenformofthecircularmoleculeisproduced.Furtherintercalationintroducesexcessturnsinthedoublehelix,resultinginsupercoilingintheoppositesense(notethedirectionofcoilingatBandD).Forclarity,onlyasinglelinerepresentsthedoublehelix.根据质粒能否在细胞间进行传递，可把质粒分为自身传递性质粒(Self—transmissibleconjugativePasmid)和非自身传递性质粒。TransferbeginsfromoriTwhichisnickedbyTraY/TraIcomplexatanicsite.F-plasmidoriToriVtra

genes32kb100kbusedtoinitiatereplicationfortransferusedtoinitiateplasmidreplicationISelements(insertionsequencesusedintransposition)F-plasmidintegratedintochromosomeinrareinstances:twomechanisms.1-homologousrecombination2-transpositionDiscreteregionthathastransfergenes:tra&trbloci(~40genes)(Originoftransfer)oriTtraM

J

YALEKBPVRCWUNtrbCDEtraFtrbBtraHGST

D

I/ZfinPTransfergenestraJactivatortraY/traITranscriptionunittraregionoftheFplasmidFig.13.20GenesVIIIDirectionoftransferregulationtra&trbloci;~40genesExpressedcoordinatelyasapartofsingletranscriptionunittraY/traIoriTtraM

J

YALEKBPVRCWUNtrbCDEtraFtrbBtraHGST

D

I/ZfinPTransfergenestraJactivatorpilinSurfaceexclusionChannel?NegativeregulatortranscripttraY/traIDNAnickingandunwindingtraregionoftheFplasmidFig.13.20GenesVIIISensesthatmatingpairformedDirectionoftransferregulationtraT-outermembraneproteinthatblocksmatingpairformation.traS-blocksDNAtransfer.traI-covalentlyattachesto5’endofDNA&unwindsitfinOHelpsfinPtraY-

recruitstraIto5’endofDNA1.Asiteontheplasmid,knownastheoriginoftransfer(oriT)isnickedbyaspecificendonuclease(oneofthetrageneproducts).2.AporeisformedbetweenthetwocellsandonlyONEstrandofDNAispassedthroughtotheothercell(5’endfirst).5’3.ThesinglestrandineachcellundergoesreplicationtoformdoublestrandedDNA.Mechanismofself-transmissibletransferOnlyasingleunitlengthofFfactoristransferredF+F-F+F+Free5’endFpiliareessentialforinitiatingpairingbutareNOTchannelsforDNAtransportDNAtransferredthroughchannelformedbyproteincodedbytraDgene.质粒DNA的迁移作用质粒的迁移作用(mobilization)同接合型质粒的自我转移过程是属于两种不同的概念。非接合型的质粒由于分子小不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自身转移。但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程叫做质粒的迁移作用。ColE1是一种可以迁移但是属子非接合型的质粒。遗传学的研究已经揭示出，ColE1质粒从给体细胞转移到受体细胞的生化过程，需要质粒自己编码的2种基因参与。一个是位于ColE1DNA上的特异位点bom；另一个是ColE1质粒特有的弥散的基因产物，即mob基因编码的核酸酶。Mechanismofplasmidmobilization1.Themobplasmidcannottransferwithoutanotherplasmid2.Theotherplasmidmayormaynotbeaself-transmissibleplasmidbutMUSTcontaintrafunctions(cellcontact,nicking).3.Iftheotherplasmidisself-transmissibleitmayalsotransfer.tratratratratramobmob基因和bom基因参与ColEl质粒的迁移作用这个纶论，是根据下面的实验结果作出的。相容性的2种质粒F和ColEl共存于同一细菌细胞中，F质粒可以为ColEl质粒提供它所缺乏的结合功能，这样使得ColEl质粒也能够发生转移作用。图A中表示位于F-细胞中的ColEl质粒的状态，它的mob基因进行了转录，其产物使bom位点发生单链断裂，而出现缺口，于是，ColElDNA便从超盘旋的结构转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程就有可能被回复，所以就出现这两种构型之间的平衡状态。图B中的细胞同时含有F和ColE1两种质粒。F因子能够导致性须的合成，为其DNA转移提供了转移装置，因此ColE1可以被转移。而当F质粒提供的这种转移装置被分离掉的情况下，ColE1的mob-突变体便不能够转移。遗传分析证明mob-突变是隐性的，mob基因编码一种蛋白质。而且当这种突变体质粒被分离出来时，并不是以松弛复合物的形式存在。图C所示F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽巳形成，但ColE1DNA并没有发生缺口。图D表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白，但由于不能够发生缺口，因此仍然不能够转移。生物安全从ColE1质粒或其亲缘关系密切的pMBl质粒派生的绝大多数的克隆载体，都已经丧失掉了编码迁移蛋白质的DNA区段。但是这种蛋白质可以由亲和性质粒，例如ColK的tran基因来补充实验中使用的许多载体分子，在其构建过程中都已经丢掉了nic位点，因此它们便不能够被迁移。要使这类质粒发生接合转移的唯一可能途径是，通过重组作用形成融合的或共整合的质粒，从而使它们在形体上变成接合型质粒的一部分。应用诸如recA这样的重组缺陷的寄主菌株，便可排除这种可能性。因此，在recA寄主中的失去nic位点的质粒载体，在生物学上要比nic+质粒载体较为“稳定”。质粒DNA的复制类型根据寄主细胞所含的拷贝数的多少可将质粒分成两种不同的复制型。一种是低拷贝数的质粒,每个寄主细胞中仅含有1~3份的拷贝，我们称这类质粒为“严紧型“复制控制的质粒(Stringentplasmid)；另一类是高拷贝数的质粒,每个寄主细胞中可高达10~60份拷贝，这类质粒被称为“松弛型”复制控制的质粒(relaxedplasmid)。质粒的接合转移能力，同它们的分子大小及复制类型之间存在有一定的相关性。一般说来，接合型的质粒具有较高的分子量,每个细胞中仅有少数几份拷贝,属于严紧型的；而非接合型的质粒，则往往具有较低的分子量,每个细胞中含有较高的拷贝数,属用于松弛型的。一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对的，这往往同寄主状况有关。pMB1andColE1repliconsRNAIIRNAIropgeneRopprotein(63aminoacids)DirectionofDNAreplication-500-300-100ori

100300500RNAseHProcessingTheRNA-DNAhybridiscleavedbyRNaseHtogenerateafree3'-OHendwhichservesasaprimerforDNApolymeraseItoinitiatereplication.DNApolymeraseIIItakesoverafterashortdistance.TheRNA-DNAhybridisNOTcleavedbyRNaseHandtranscriptioncontinuesnonproductively.ThechoicebetweenthesefatesdependsontheformationofaspecificsecondarystructureinthenascentRNAIItranscript.IfthestructureformscorrectlythenRNaseHprocessingoccurscorrectly;ifnot,itdoesnot.Clearly,anythingthatinterfereswiththeformationofthecorrectsecondarystructurewillinterferewithplasmidreplication.ThereisaspecificRNAwhosefunctionistodojustthat!RNAIisa108ntmoleculewhichistranscribed--intheoppositedirectiontoRNAII--fromapromoterlocatedbetweentheRNAIIpromoterandtheoriginofreplication:SinceRNAIisperfectlycomplementarytoRNAII,itisabletoformastableRNA-RNAhybridwithit.Ifitdoes,thenRNAIIwillnotbeabletofunctionasaprimer.ThisisanexampleofantisenseRNAregulation.ReplicationofColE1alsodependsontheRopprotein.Ropisasmallprotein(63aas)whichincreasestherateofbindingofRNAItoRNAII.IfRopisabsent,plasmidreplicationwillbemorefrequent.pMB1andColE1RepliconsSowhatwillhappenifwealterRNAIorrop?DecreasenegativeregulationofRNAIIMoreRNAIIavailableMoreplasmidreplicationExamplepUCplasmidshaveasinglemutation(G->A)onenucleotideupstreamoftheinitiationofRNAI.pUCplasmidshave500-700copiespercellTherelativecopynumbersofpBR322andpUC18illustratethe

roleofRop

perfectly.Thereareapproximately15copiesofpBR322percell;however,thereare50-100copiesofpUC18,whichisderivedfrompBR322.TherelevantdifferencebetweenthetwoplasmidsisthefactthatpBR322containstheropgenebutpUC18doesnot.质粒的亲和性Plasmidcompatibility–theabilityoftwodifferentplasmidstoco-existinthesamehostPlasmidsthatutilizethesamereplicationsystemcannotco-existinthesamebacterialcellPlasmidscarryingthesamerepliconbelongtothesameincompatibilitygroup2.大肠杆菌质粒载体

pSC101质粒载体9.09kb严紧型复制控制的低拷贝数质粒。

pSCl01质粒是从接合型质粒R6-5派生出来的，而R6-5又是分子大小为97kb的R6质粒的一种衍生物。

StanleyN.Cohen1973获得的。R6-5DNA经流体切割环化，转化大肠杆菌，四环素抗性转化子中分离出来的.R6质粒携带有抗链霉素、磺胺、氯霉素、卡那霉素及四环素等多种抗性基因。在R6-5质粒上四环素抗性基因已经丧失，但仍保留者其它几种药物抗性基因。克隆非洲爪蟾(Xenopusleavis)rDNAColE1质载体

松弛型复制控制的多拷贝的质粒编码有大肠杆菌素E1基因(cea)还编码有使寄主细胞具有对大肠杆菌素E1免疫性的基因immE1

在EcoRI位点上插入外源DNA，虽然使它失去了产生大肠杆菌素E1的能力，但却不影响其DNA复制活性，以及对大肠杆菌素E1的免疫性能。对大肠杆菌素的免疫性特征可作为一种选择标记。以大肠杆菌素E1为例，这种蛋白质是由Co1E1质粒控制合成的，它对于不含有Co1E1质粒的敏感细胞有致死效应，而对于带有Co1E1质粒的细胞则无此反应。我们可以应用类似于检测噬菌体的方法，来检测大肠杆菌素EI的产生：将产生大肠杆菌素E1的寄主细胞涂布在由敏感细菌生长的菌苔上，由寄主细胞分泌出来的大肠杆菌素E1，会抑制周围敏感细胞的生长并使之致死，于是便会在看起来显得混浊不透明的菌苔背景上出现空班的清亮区。

但如果