千日红花色苷的酶法提取及层析技术的应用

千日红花色苷的酶法提取及层析技术的应用

颜色信号是一种由保湿草和糖苷组成的化合物。它广泛存在于植物、水果、茎、叶和根等器官细胞中。它是一种天然的食用色素，安全无害，具有一定的营养和理气。纤维素酶可使纤维素、半纤维素等物质降解,从而增大胞内有效成分向提取介质的扩散,可以提高色素提取效率。具有成本低,提取条件温和,有效成分理化性质稳定,无有机溶剂残留等优点。文中主要对千日红花色苷的酶法提取、纯化进行了初步研究,为综合利用千日红花卉,提高其附加值提供理论依据。1材料和方法1.1主要材料千日红干花(市售)。纤维素酶、DNS试剂、磷酸缓冲液等分析纯试剂。1.2仪器、仪器和仪器SHZ?-A水浴恒温振荡器,上海跃进医疗器械厂;XT42000C精密电子天平,Precisa仪器有限公司;721-E型分光光度仪,上海精密科学仪器有限公司;HWC-51型恒温水槽,上海天平仪器厂;FW80万能粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司。1.3试验内容1.3.1酶法提取1000天红色花芽1.3.1.1.工艺线千日红花瓣→干燥→粉碎→加入缓冲溶液→酶解→灭酶→抽滤→调pH值→柱层析→真空浓缩→冷冻干燥→花色苷成品1.3.1.千日红干花粉磷酸缓冲液色价的测定预先对影响酶法提取千日红花色苷的温度、pH值、酶用量、提取时间、固液比进行试验,并以色价作为评价指标,筛选出酶法提取千日红花色苷的较适宜工艺参数。(1)温度的影响取千日红干花粉2g,20~40℃下酶解,pH6.0,酶用量2.0μg/g,千日红干花粉∶磷酸缓冲液=1∶15,酶解60min。酶解后2000r/min离心,取上清液8mL,以1∶4比例稀释,测定其色价。(2)pH值的影响取千日红干花粉2g,25℃下,酶用量2.0μg/g,千日红干花粉∶磷酸缓冲液=1∶15,分别在pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的条件下酶解60min,然后2000r/min离心,取上清液8mL,以1∶4比例稀释,测定其色价。(3)酶用量的影响取千日红干花粉2g,25℃,pH6.0,千日红干花粉∶磷酸缓冲液=1∶15,在酶用量1.0~10.0μg/g的条件下酶解60min,然后2000r/min离心,取上清液8mL,以1∶4比例稀释,然后测定其色价。(4)时间的影响取千日红干花粉2g,25℃,pH6.0,=1∶15,酶用量2.0μg/g条件下,酶解30、60、90、120、150min,然后2000r/min离心,取上清液8mL,以1∶4比例稀释,测定其色价。(5)固液比的影响取千日红干花粉2g,25℃,pH6.0,酶用量2.0μg/g,酶解60min条件下,千日红干花粉∶磷酸缓冲液为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16进行酶解,酶解后2000r/min离心,取上清液8mL,以1∶4比例稀释,然后测定其色价。1.3.1.颜色=5a30n的三个颜色值其中:A530为千日红花色苷在530nm处的吸光度值;N为比色时稀释的倍数。1.3.2纯化条件的确定采用100~200目的层析用硅胶进行分离纯化,分别从径长比和层析柱柱温2个方面,以色价作为评价指标,考察关于千日红花色苷的较适宜的纯化条件。1.3.2.千日红花色苷的分离纯化选用的固定内径为1.5cm,柱温为室温,分别在径长比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的条件下对千日红花色苷进行分离纯化,测定其色价。1.3.2.2.柱温的影响在径长比为1∶5的条件下,分别在20~50℃的条件下进行分离纯化,然后测定其色价,并找出较适宜的纯化温度。1.3.2.千日红花色苷的吸收光谱在较适宜的酶解和纯化工艺条件下得到的千日红花色苷,按照1∶4的比例进行稀释,测定400~600nm范围内的吸光度值,绘制可见吸收光谱。2结果与讨论2.1酶法提取了1000天红色花芽的试验结果2.1.1提取温度对花色苷的影响由图1知,在一定温度范围内,随着温度的升高,千日红花色苷的色价也随着升高,这主要是由于温度的升高使纤维素酶的活力增强,提高了酶解反应的速度,加快了纤维素的降解,使花色苷得以释放,30℃与35℃的结果接近,高于35℃后色价迅速降低,综合考虑,确定较适宜的提取温度为30℃。2.1.2酶解对花色苷色价的影响由图2知,pH值在6~7时花色苷的色价最高,继续对pH在6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0条件下酶解的试验结果进行考察,结果如图3所示,pH值为6.8时,所得花色苷色价最高,这是因为在酶的最适pH值条件下,降解反应速率是色价的最高值。同时pH值对花色苷本身的稳定性和显色也有较大的影响。2.1.3酶解饱和反应速率反应速率随酶用量的增加而提高,试验结果表明,反应速率与酶浓度为直线图形,但当酶用量超过一定量时,酶解反应饱和反应速率不再增加。如图4所示。酶用量在1.0~4.0μg/g时,花色苷色价增长缓慢,酶用量在4.0~6.0μg/g之间时,花色苷色价迅速上升,酶用量超过6μg/g时,增长趋于平缓,因此,较适宜的酶用量为6.0μg/g。2.1.4时间的限制由图5知,花色苷色价随酶解时间的延长而增加,当时间增加到一定值后,色价则不再增加,较适宜的酶解时间为60min。2.1.5色价变化情况试验结果表明,在一定的固液比范围内,随着千日红与缓冲液质量比的增加,花色苷色价也随之增加,如图6所示,当固液比在1∶1~1∶10时,花色苷色价迅速上升,在1∶10~1∶16时,花色苷色价呈递减趋势。因为在酶解过程当中随着固液比的增加,液体在千日红细胞内的扩散能力增强,有利于酶对千日红花纤维的降解,使得千日红细胞迅速破坏,但是随着固液比增加,酶的浓度也随之减少,酶解反应速率也随之降低,因此判断较适宜的酶解固液比为1∶10。2.2红景天酚的分离和提取以硅胶为吸附层析介质,从径长比与层析柱柱温方面考察千日红花色苷较适宜的分离纯化条件。2.2.1柱长和柱长对千日红花色苷色价的影响室温下,在固定内径为1.5cm,径长比为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的条件下对千日红花色苷进行分离纯化试验结果如图7所示,随着层析柱长度的增加,分离纯化效果越好,柱长由7.5cm增至45cm时,千日红花色苷的色价由2.8上升到3.7。2.2.2色谱温度对千日红花色苷色价的影响选用长度为7.5的层析柱,结果如图8所示,当柱温从20℃上升到35℃时,所得花色苷色价迅速上升,当温度上升到40℃以后花色苷色价增长趋于平缓,综合考虑,本试验采用35℃作为千日红花色苷柱层析纯化的较适宜的温度。其中可能是因为随着温度的上升,分子运动速度加快或者使得固定相与要分离组分的吸附解析能力增强,但随着温度的上升,花色苷呈现出不稳定的一面,因此色价迅速降低。2.3红景