叶绿素荧光在光谱法测定污水中的应用

叶绿素荧光在光谱法测定污水中的应用

0叶绿素荧光检测自1957年提出使用藻类法去除废水中的氮和磷养分以来，人们越来越重视具有应用价值的生物工程对废水的处理。大量资料表明,利用藻类的吸收、富积和降解作用,可有效去除污水中的重金属和营养盐,还能降解多种有机毒物如农药、烷烃、酚类、邻苯二甲酸酯、三丁基锡、偶氮染料等。因此,研究藻类的光合作用,从而为藻类提供更好的生长条件就变得非常必要。叶绿素荧光作为光合作用的探针,得到了广泛的研究和运用,它是由传教士Brewster于1834年首次发现的。叶绿素荧光不仅能反映光能吸收、激发能传递和光化学反应等光合作用的原初反应过程,而且与电子传递、质子梯度的建立及ATP的合成和CO2固定等过程有关。几乎所有光合作用过程的变化都可通过研究叶绿素荧光反映出来。荧光测定技术与分光光度法比较,其优点有:分光光度法测定水体中叶绿素a含量的步骤较为繁琐,耗时较长。荧光法测定水体中叶绿素a的灵敏度、精密度和准确度较好,该法测定结果与分光光度法无显著性差异,而且具有简便快捷的特点。1藻类光合色素对其捕光能的影响真核藻类的光合作用是在叶绿体中进行的,进行光化学反应和电子传递的成分都位于叶绿体内的类囊体膜上。光合作用的第一步是利用光合色素捕获光能,藻类的光合色素多种多样,这有利于不同的藻类适应不同的生活环境。游离的色素分子不具有捕获光能的功能,只有与蛋白质结合形成捕光色素蛋白复合体,才能执行起捕获光能的作用。而表征藻类光合活性的参数主要是光合色素,它可以分为3类:叶绿素(Chlorophylls)、类胡萝卜素(Carotenoids)和藻胆蛋白。所有藻类均含有叶绿素和类胡萝卜素,只有蓝藻、红藻、隐藻和某些原绿球藻含有藻胆蛋白。1.1绿核子1.1.1叶绿素a、b、c、c、c、c、d叶绿素含量和光合作用密切相关,是反映藻类生理状态的重要指标。目前发现,存在于藻类中的叶绿素种类有:叶绿素a、叶绿素b、叶绿素c1、叶绿素c2、叶绿素c3和叶绿素d。所有放氧光合生物均含有叶绿素a,大部分还含有叶绿素b或叶绿素c1、c2和c3,而叶绿素d只在某些红藻中存在。目前已知叶绿素a、b、c1、c2、c3、类胡萝卜素和藻胆蛋白均可起捕获光能的作用。叶绿素a(Chlorophylla)代表绿色的光合作用色素,所有活着的藻类中均有,能够被直接测定,并用来作为藻类生物量多寡的主要指示;叶绿素b(Chlorophyllb)和叶绿素c(Chlorophyllc)是一种辅助色素,只存在于一些特殊藻类中,能够影响叶绿素a测定的精确性。由于不同的藻类所含有的叶绿素种类不同,而且各种叶绿素在藻类中的比例不同,因此,可以通过测定各种叶绿素的比值来确定未知藻类的种属。1.1.2最大波长的确定叶绿素吸收光的能力很强,如果把叶绿素溶液放在光源和分光镜之间,就可以看到有些波长的光线被吸收了。在光谱中就出现了暗带,这种光谱叫吸收光谱。2个最强烈的吸收区,一个是波长为640nm～660nm的红光部分,另一个是430nm～450nm的蓝紫光部分。此外,在光谱的橙光、黄光和绿光部分只有不明显的吸收带,其中尤以对绿光的吸收最少,所以叶绿素的溶液呈绿色。1.2双酰氧基类化合物叶黄素和环黄素藻类中的类胡萝卜包括2大类:胡萝卜素(Carotenea)和叶黄素(Xanthophylls)。这2种色素都有许多不同的类型,胡萝卜素是纯粹的碳氢化合物,而叶黄素是由胡萝卜素衍生的醇类,它在叶绿体的结构中与脂类物质相结合。类胡萝卜素的最大吸收光谱在蓝紫光部分,不吸收红光等波长的光。1.3藻蓝蛋白和pec藻胆蛋白存在于蓝藻、红藻、隐藻和一些原绿球藻中,主要有4类:藻红蛋白(Phycoerythrin,PE)、藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanin,PEC)、藻蓝蛋白(Phycocyanin,PC)和别藻蓝蛋白(Allophycocyanin,APC)。其中PE和PEC呈红色,PC和APC呈蓝色。藻胆蛋白主要吸收波长为450nm～660nm的光,其中PE的吸收峰在490nm～570nm,PC在620nm有一主吸收峰,APC在650nm有一主吸收峰。2从基态到激发态藻类细胞内的叶绿素分子通过直接吸收光量子和间接通过捕光色素吸收光量子得到能量后,从基态(低能态)跃迁到激发态(高能态),并产生荧光。叶绿素荧光仪就是基于对叶绿素变化的检测而发展起来的,目前,这项技术在国外的植物学、藻类学和国内的植物学等领域得到了广泛应用。本文仅讨论叶绿素荧光法在藻类光合作用中的应用。2.1荧光分子检测荧光分子的特征叶绿素a是绿色的光合作用色素,是衡量藻类生物量的主要标志,是一种其浓度能被荧光仪测定的荧光分子。光线的变化、温度、浊度、可溶物质和藻类健康状况均对荧光有显著影响,从而影响叶绿素a浓度的确定。1.2.1细胞退到中间光线的变化对藻细胞中的荧光有显著的影响。在光线较低的时候,藻细胞会将叶绿体退到细胞的外围以获得更多的光线,或者产生更多的叶绿体。这2种反应会导致不实的荧光数据,而不能代表实际的藻类生物量。而当光线太强时,藻类的生长会受到抑制而导致荧光低估了藻类的生物量。1.2.2温度影响所有的荧光都不同程度的受温度影响,温度与荧光成反比。1.2.3影响水质的因素可溶解物质、叶绿素的降解产物(脱镁叶绿素)、辅助色素(叶绿素b和c)和浊度均会影响荧光。1.2.4荧光光谱分析被藻细胞中包含的叶绿素吸收的光能有3种去向:被用于光合作用;产生热;以荧光形式重新发射。由于“健康”的藻细胞所吸收的光能可以充分地用于光合作用,因而发射的荧光就比“垂死”的藻细胞少。2.2光化学的有效用量荧光随时间变化的曲线称为叶绿素荧光诱导动力学曲线。通过研究叶绿素荧光曲线可以获得许多重要的信息。下面分析一些常见的光化学反应参数。2.2.1Fv/Fm它被称为PSⅡ的最大光化学量子产量,反映的是当所有PSⅡ反应均处于开放状态时的量子产量,是应用最广、使用频率最高的一个参数。在正常生理状态下,它是一个很稳定的值,藻类约为0.65。当藻类受到胁迫时,其值显著下降。因此,它可作为研究光抑制或各种环境胁迫对光合作用影响的重要指标。2.2.2Fv′/Fm′被称为PSⅡ光化学的有效量子产量,代表了激发能被开放的PSⅡ反应中心捕获的效率,它定量了由于热耗散的竞争作用而导致PSⅡ的光化学被限制的程度。2.2.3ФII被称为PSⅡ光化学能量转化的有效量子产量。在正常情况下,与CO2固定有很好的线性关系,但样品受到胁迫时,由于光呼吸或假环式电子传递的影响,与CO2的固定并不呈线性关系。2.2.4qp被称为叶绿素荧光的光化学淬灭,即激发能被开放的PSⅡ反应中心捕获并转化为化学能而导致的荧光淬灭,反映了光适应状态下PSⅡ进行光化学反应的能力,也即开放的PSⅡ反应中心所占的比例。2.3qn的荧光光谱非光化学通常用非光化学淬灭系数来表征。常用的非光化学淬灭系数有2个:qN和NPQ。qN代表可变荧光的非光化学淬灭,反映了样品从暗适应状态下到光适应状态下时非光化学过程对叶绿素荧光发射的影响。NPQ是从Stern-Volmer方程衍生出来的,常被作为光适应状态下PSⅡ的天线系统将过量光能耗散为热能的指标。2.4光机构调节和光保护的控制因素藻类的光保护机制可以分为2大类:(1)降低对光能的吸收。单细胞藻类可以通过改变浮力或垂直迁移离开水表面层,避免吸收过多的光能;藻类也可以通过调节色素天线的大小来调节对光能的吸收。(2)通过各种途径耗散过多的激发能。人们通常认为的光保护耗散途径主要以非光化学淬灭途径为主。因此,叶绿素荧光的变化可以在一定程度上反映环境因子对藻类光合作用的影响,通过对不同环境条件下叶绿素荧光诱导动力学曲线的分析,可深入了解以上这些因素对藻类光合机构主要是PSⅡ的影响以及光合机构对环境的适应机制。如:藻类生理变化如衰老,或者逆境胁迫如缺铁或锰饥饿等都能够直接或间接地影响藻类PSⅡ的功能。2.5光照和光照对藻类光损伤的影响当藻类处于不适宜的光照强度时,光系统就会受到不同程度的损伤,从而造成光合能力的下降。水环境当中的光抑制发生于2种情况下:生长在水体表层或接近表层的藻类,当白天的光照很强时易发生光抑制;生长在真光层下层的藻类在上升流、潮汐或风的作用下突然上升到水体表层并经受强光照射时易发生光抑制。一般认为,当光强低于半饱和光照强度Ik时,光损伤会明显加剧。例外,通过测量光合作用的电子传递和CO2的供给也可以反映藻类的光损伤。通常情况下