实验汇报(提总RNA及RT-PCR)-叶跃天

Trizol法提总RNA及RT-PCR技术Trizol法提总RNA

Trizol是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。实验原理一、实验准备仪器：离心机、恒温箱、涡旋仪、酶标仪、水浴锅、PCR仪、上样电泳仪、电子天平等工具:泡沫盒、手套（线、乳胶、塑料薄膜）、EP管、研钵、多型号微量移液器、RNA专用枪头、试管、量筒等。试剂:液氮、无水乙醇、DEPC水（焦磷酸二乙酯：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，有高致癌性）、TRI-ZOL、氯仿、异丙醇、核酸胶（琼脂粉、TAE缓冲液、EB）、Loadingbuffer（上样缓冲液）、Marker（分子标记）、反转录引物、反转录试剂盒、PCR试剂盒等。样本：根据实验要求取样。二、注意事项(一)试验中会遇到有毒有害试剂，所以在试验中务必遵守实验规程，带好手套及口罩，勿随手触摸试剂等。(二)RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。1、人的唾液和汗液含有RNA酶，故在操作中应戴手套，避免讲话。2、实验所用枪头、EP管须在DEPC水中过夜浸泡，取出后放在高压蒸汽灭菌箱内处理，121℃、30分钟。3、研钵洗净后放在鼓风干燥箱内处理，180℃、6小时。取出后冷凉，再放入-80℃冰箱中预冷。4、实验开始之前要先将37℃恒温箱打开。同时打开水浴锅，温度分别调到65℃和42℃。三、试验流程取材：取少量液氮于泡沫盒中，从-80℃冰箱中取出样本、研钵、研磨棒。样品投入液氮中。配置裂解液：取8支EP（标记，以后做转移时都要标记），各加1mlTri-zol+10ul蛋白酶水。研磨：用镊子取适量样品与研钵中研磨，研磨过程中不断添加液氮（防止化冻，内源性RNA酶降解RNA）。研磨充分后用枪头尽可能快地将样品转入事先准备好的裂解液中，剧烈震荡。静置15min。三氯甲烷：向8支EP管中各加200ul三氯甲烷（枪头悬空加，不用换），充分混匀后，静置15min。离心：15min后，12000rpm-4℃-15min异丙醇：离心完成后，吸出上清转移至另8支EP中，再加入500ul异丙醇（沉淀RNA），静置10min。离心：10min后，12000rpm-4℃-10min离心完成后，倒掉上清，向各管中加入1ml75%乙醇。直接离心，10000rpm-5min离心后，倒掉上清，稍微离心，取出，用虹吸的方法洗出残留的乙醇。晾置10min。当RNA边缘约1/3开始透明时，加适量DEPC水（一般约20-30ul），RNA较多时可加35-40ul。37℃恒温箱中，30min。RNA提取结果的鉴定1、将恒温箱中的RNA取出，轻轻吹打，并转移至另8支EP（作详细编号，eg：热对1-1,2013.11.9）2、从上述含有RNA的EP中各取3ul，放到酶标仪的板上（加一组DEPC水作为对照）3、测吸光度：设定在230nm、260nm、280nm处的吸光度。设置预计算，计算A260/A280是否在1.8-2.0之间。（若比值高于2.0，表明RNA有降解，若低于1.8，表明RNA被污染，可能是蛋白质或是酚污染。）4、打开酶标仪中EXCEL表格，输入EP对应的编号，并找出各自对应的A260的值，保存，计算出RNA的浓度。[RNA]=A260×40×稀释倍数/1000(ug/ul)

本实验定量RNA为0.1ug，由此可根据RNA浓度，计算出每个样本RNA所需要的体积。因为之后的反转录体系为20ul，RNA+H2O=10ul，由此再计算出所加水的体积。eg：假设A260/A280=2.0得到[RNA]=2.0×40/1000=0.08ug/ulVRNA=0.1/0.08=1.25ul

VH2O=10-1.25=8.25ul反转录反转录是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式。反转录的简要过程表示如下：反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3′桹H末端上，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementaryDNA,cDNA)，它与RNA模板形成RNADNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。1、取16支EP，分为两组：H组（HSP，热休克蛋白）和G组（GAPDH,内参蛋白），编号：热对-1,11.9，H。2、配制反转录体系20ul：12ul：上游引物：1ul下游引物：1ulRNA+H2O：10ul轻微离心，65℃水浴5min。取出后置于冰上。同时配置8ul体系：本实验16支EP，按18支量配，以防不足。buffer4ulriblock1ul10mMdNTP2ul反转录酶抑制剂1ul配制完成后，16支EP各加8ul，轻微离心。水浴锅中，42℃，2h。可以混合后添加（H和G组要分开）PCR（DNA）扩增

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

1、准备16支小EP，备用。2、配制PCR反应体系，25ul，分三步添加。按18支配制，以防不足。①模板5ul②上游引物1ul下游引物1ul③10×buffer2.5uldNTP2ul酶0.2ulDEPC水13.3ul3、添加完成后，轻微离心。4、将小的EP放入PCR仪中。设置好步骤，温度（98℃、56℃、72℃）、循环数（30）后开始扩增。可以混合后添加（H和G组要分开）琼脂糖凝