八生物药物制备技术概论

第二章生物药物制备技术概论第一节生物材料与生物活性物质一、生物材料的来源供生产生物药物的生物资源主要有动物、植物、微生物的组织、器官、细胞与代谢产物。应用动植物细胞培养与微生物发酵技术也是获得生物制药原料的重要途径。基因工程技术与细胞工程技术和酶工程技术更是开发生物制药资源的新途径。（一）动物脏器（1）胰脏（激素、酶、多肽、核酸、多糖、氨基酸等）（2）脑（脑磷脂、肌醇磷脂、神经磷脂、神经肽等）（3）胃粘膜（胃蛋白酶、胶原蛋白酶、胃泌素、胃膜素）（4）肝脏（维生素、磷脂类、胆固醇）（5）脾脏（免疫器官）（6）小肠（糖蛋白、核苷酸酶、溶菌酶、胃肠道激素）（7）脑垂体（各种激素）（8)心脏（细胞色素C、辅酶Q10）其它等（二）血液、分泌物和其它代谢物血液制品：人血制剂、抗凝血酶Ⅲ，凝血因子Ⅷ，纤维蛋白原，免疫球蛋白、人血浆、干扰素、白介素等。尿液、胆汁、蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料，尿激酶，表皮生长因子、HCG（三）海洋生物（1）海藻（2）腔肠动物海葵毒素（3）节肢动物甲壳素（4)软体动物多糖、多肽、毒素（5）棘皮动物海星、海胆、海参海参素抗癌（6）鱼类鱼油、多种激素、毒素，硫酸软骨素（7）爬行动物龟滋阴养肾抗肿瘤（8）海洋哺乳动物鲸鱼鱼肝油（四）植物生物碱、强心甙、黄酮、皂甙、挥发油、树脂、鞣质等。（五）微生物1.细菌常用细菌发酵法生产乳酸、醋酸、丙酮、丁醇。主要有：（1）氨基酸利用微生物酶可转化对应的α酮酸或羟基酸作用产生氨基酸。（2）有机酸柠檬酸、苹果酸、乳酸（3）糖类利用细菌可制取葡聚糖、聚果糖、聚甘露糖、脂多糖。（4）核苷酸类用细菌可生产5‘－AMP，5’－肌苷酸（5）维生素VB1,VB2，VB6,Vc（6）酶淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、弹性蛋白酶2.放线菌放线菌是最重要的抗生素产生菌，已有1000多种抗生素约2/3产自放线菌。（1）氨基酸发酵法（2）核苷酸5-脱氧肌苷酸（3）维生素（4)酶3.真菌（1)酶（2）有机酸（3）氨基酸（4）核酸及有关物质（5）维生素（6)促生素（7）多糖4.酵母菌（1）维生素（2）蛋白质与多肽（3）核酸（六）开发生物新资源（1）动植物细胞的大规模培养（2）应用基因工程技术建立工程菌或工程细胞二、生物活性物质的存在方式（一）生物活性物质的存在方式与其生物功能根据生物活性物质的生物功能推断其存在部分和分布方式。生物活性物质分为胞内与胞外两种存在部位。（二）生物分子间的作用力三、生物活性物质的存在特点（一）生物材料组成的复杂性（二）生物活性物质存在地特点生物活性物质在生物材料中含量较低，杂质含量很高，而且生理活性愈高，含量愈低。生物材料中的生化组成数量大，种类多，分离纯化比较困难。四、生物材料的准备生物材料的制造主要包括以下工艺过程：1)生物材料的选取与预处理；2)从生物材料中提取有效活性物质；3)有效成分的分离，纯化4)后处理及制剂（一）生物材料的选取1.有效成分的含量（1）生物品种根据目的物的分布，选择富含有效成分的生物品种是选材的关键。（催乳素，哺乳动物）（2）合适的组织器官（胃蛋白酶，胃）（3）生物的生长期生物的生长期对生理活性物质含量影响很大。2.杂质情况难于分离的杂质会增加工艺的复杂性，严重影响收率、质量和经济效益。3.来源应选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料，最好能一物多用，综合利用。胰脏制备弹性蛋白酶和激肽释放酶，胰岛素与胰酶等。（二）生物材料的采集与保存生理活性物质易失活与降解，采集时必须保持材料的新鲜。防止腐败、变质与微生物污染。如胰脏采摘后要立即速冻，防止胰岛素活力下降。保存生物材料的主要方法有速冻、冻干、有机溶剂脱水，制成丙酮粉，或浸存于丙酮与甘油中等。（三）动物细胞的培养与保存（四）微生物菌种的选育与保存1.菌种的分离微生物种类繁多，易于培养，是工业化生产各种生物药物的主要材料。（1）含菌样品的收集根据微生物的生态特点，从自然界取样，分离所需要菌种，如到堆积和腐烂纤维素的地方去取样分离纤维素酶产生菌。到温泉附近取样分离高温蛋白酶产生菌。一般可以从土壤中分离所需微生物，取样时先将表土刮去2~3cm，在同一条件下选好2~5点土样混在一起包好，表明采样地点及日期备用。（2）富集培养收集到的样品若含所需要的菌较多，可直接分离。如含所需要的菌很少，就需要经过富集培养，使所需要的菌大量生长，以利于筛选。再配合控制温度，pH或营养成分即可达到目的。有时用能分解的底物作为生长和诱导产生所须成分的培养基成分，以使所需要的菌种得到快速生长，有利于进一步分离。（3）菌种纯化在自然条件下，各种类型的菌混杂在一起生活，所以要进行分离，以获得纯种。菌种纯化的方法一般采用稀释分离或划线分离法。2.菌种的筛选（1）筛选对象的选择筛选前，先要考虑哪些微生物是筛选的对象。如有报道，则根据文献收集可能性最大的的微生物进行筛选。（2）培养方式的确定微生物的培养方式，有固体培养与液体培养。3.菌株的选育从自然界直接分离得到的菌种，都不能立即适应实际生产需要。只有通过诱变，选育才能使产量成倍，成百倍地提高。选育方法基本上可以分成两类：随机选择突变体；根据代谢的调节机制选择各种突变体。（1）随机选择法一般程序是采用诱变剂诱变处理微生物，增殖培养，经过稀释涂布，随机选择部分或全部单菌落，逐个测定它们的生物活性。最后挑选出产量或其它性能比亲代菌株优秀的突变株。（2）根据代谢的调节机理选择高产突变体根据代谢的调节机理选择高产突变体。(抗性基因)4.菌种的保藏（1）菌种的退化与防止生产菌种本来在自然环境下生长，所以在人工培养条件下，任何菌株通过一系列的转接传代都可能发生退化。退化—一般把菌株的生活力，产孢子能力的衰退和特殊产物产量的下降，成为退化。菌种退化现象：①单位容积中发酵液的活性物质含量；②琼脂平皿上的单菌落形态；③不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特征。如形成孢子能力；④发酵过程pH变动情况；⑤发酵液的气味、色泽。菌种退化防止措施：①防止基因突变，基因突变是菌种退化的一个主要原因，低温保藏法可以减少突变得产生。②采用双重缺陷型采用双营养缺陷标志可间接而有效地防止突变。③制定科学管理制度制作平行菌种斜面；④分离单菌落；认真进行单菌落分离工作，再多做平行的菌种斜面；⑤选择培养条件选择有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。（2）常用的菌种保藏方法斜面保存法—将菌种转接到新鲜的琼脂斜面上，待生长良好后，于4℃保存。根据具体情况，间隔一定时间后转接。矿油法—在菌种斜面上覆盖矿物油以隔绝空气防止蒸发。索氏法—将小试管斜面的菌种放在大试管内，大试管内装几粒氢氧化钾，管口加橡皮套，然后用石蜡包封。干硅胶法—试管内装硅胶约半满，180℃加热灭菌1.5小时，置密封干燥器内冷却，接种菌液约1ml，塞好棉花，放入预置有色硅胶的大瓶中，蜡封瓶口，于低温处保存。砂土管法—取普通黄沙，洗净过60目筛，晒干，另取普通圆土研碎，过筛，晒干。两者以6:4混合。分装于安醅瓶或小试管中，然后在60℃干热灭菌2小时，连续灭菌三次后即可使用。装管时可吸取少许孢子悬浮液加入，待干燥后抽真空封口或用棉花塞紧后蜡封，低温保藏。冷冻干燥法：将菌种悬浮于脱脂消毒牛奶中，快速冷冻，真空干燥。甘油冷冻保存法：将对数期菌体悬浮于新鲜培养基中，加入15%消毒甘油，混匀速冻，冻存于－70~－80℃.（五）组织与细胞的破碎组织与细胞的破碎方法有物理法、化学法与生物法。1.物理法（1）磨切法工业上常用的有绞肉机，刨胰机，球磨机、磨粉机。实验室常用的有匀浆机，研钵，高速组织捣碎机。（2）压力法有压榨法、高压法和减压法，渗透压法。（3）超声波法（4）反复冻融法2.化学法用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂或表面活性剂处理细胞，可破坏细胞结构释放出内容物。3.生物法（1）组织自溶法利用组织中自身溶解酶的作用改变、破坏细胞结构，释放出目的物称为组织自溶法。(2)酶解法用外来酶处理生物材料，如用溶菌酶处理某些细菌，蜗牛酶等（3）噬菌体法用噬菌体感染细胞、裂解细胞，释放出内容物。（六）细胞器的分离为获得结合在细胞器上的一些生化成分或酶系，常常要先得到细胞器再进一步分离有效成分。方法是匀浆破碎细胞，差速离心。第二节生物活性物质的提取提取是利用制备目的物的溶解特性，将目的物与细胞的固形物成分或其它结合成分分离，使其由固相转入液相或从细胞生理状态转入特定溶液环境的过程。一、物质性质与提取（一）物质的性质与提取方法的选择要取得好的提取效果，最重要的是要针对生物材料和目的物的性质选择合适的溶剂系统与提取条件。生物材料及其目的物与提取有关的一些性状包括溶解性质、分子量、等电点、存在方式、稳定性、比重、粒度、粘度，目的物含量，主要杂质种类及溶解性质，有关酶的特征等。其中最主要的是目的物与主要杂质在溶解度方面的差异以及它们的稳定性。操作者可根据文献资料及本人的试验摸索获得的有关信息，在提取过程中增加目的物的溶出度，尽可能减少杂质的溶出度。（二）活性物质的保护措施（1）采用缓冲盐系统在生物药物制备中，常用的缓冲盐有磷酸缓冲盐，柠檬酸缓冲盐，Tris缓冲液，醋酸缓冲盐，碳酸缓冲盐，硼酸缓冲盐和巴比妥缓冲盐等。（2）添加保护剂防止某些生理活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏，如巯基是许多活性蛋白质和酶催化活性基团，极易被氧化，故提取时，常添加某些还原剂如半胱氨酸，－巯基乙醇。对易受重金属影响的，可添加EDTA。（3）抑制水解酶的作用（4）其它保护措施（冷、热、酸、碱）二、物质的性质与溶解度（一）物质溶解度的一般规律相似相溶（二）水在生化物质提取中的作用水是提取生化物质的常用溶剂。水分子的存在可使其它生物分子之间的氢键减弱，而与水分子形成氢键，水分子还能使溶质分子的离子键解离，这就是所谓的水合作用。水合作用促使蛋白质、核酸、多糖等生物大分子与水形成了水合分子或水合离子从而促使它们溶解于水或水溶液中。三、提取效率四、影响提取的因素（一）温度多数物质的溶解度随提取温度的升高而增加。另外较高的温度可以降低物料的粘度，有利于分子扩散和机械搅拌，所以对耐热成分的提取可以用加热的方法。对不耐热的生物活性物质的提取，一般在0~10℃进行提取。(二)酸碱度多数生化物质在中性条件下较稳定，pH值一般应控制在4～9范围内，为了增加目的物的溶解度，往往要避免目的物的等电点附近进行提取。巧妙地选择溶剂系统的pH值不但直接影响目的物与杂质溶解度，还可以抑制有害酶类的水解破坏作用，防止降解，提高收率。（三）盐浓度盐溶作用盐析作用五、提取方法（一）用酸、碱、盐水溶液提取（二）表面活性剂提取表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，分布于油水界面时，有分散、乳化和增溶作用。表面活性剂分阴离子型、阳离子型与非离子型。离子型表面活性剂作用强，但是易引起蛋白质等生物大分子的变性，非离子表面活性剂变性作用小，适合于用水、盐系统无法提取的提取的蛋白质或酶的提取。（三）有机溶剂提取1.固－液提取丙酮从动物脑中提取胆固醇，溶剂分级提取：如先用丙酮，再用乙醇，最后用乙醚提取。石油醚，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，甲醇。丙酮粉2.液－液萃取液－液萃取是利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异，将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。分配系数和溶剂用量溶剂萃取的注意事项：（1）pH在萃取操作中正确选择pH值很重要。因为在水溶液中某些酸、碱物质会解离，在萃取时改变了分配系数，直接影响提取效率。（2）盐析加入中性盐如硫酸铵，氯化钠等可以使一些生化物质的溶解度减少，这种现象成为盐析。在提取液中加入中性盐，可以促使生化物质转入有机相从而提高萃取率。（3）温度一般在室温下或低温下进行萃取操作。（4）乳化在液液萃取时，常发生乳化作用，使有机溶剂与水相分层困难。去乳化的常用方法有：过滤与离心，轻轻搅动，改变两相的比例；加热，加电解质，加吸附剂。液液萃取时溶剂的选择：（1）选用的溶剂必须具有较高的选择性，各种溶质在所选的溶剂之间分配系数差异愈大愈好。（2）选用的溶剂，在萃取后，溶质与溶剂要容易分离与回收。(3)两种溶剂的密度相差不大时容易形成乳化，不利于萃取液的分离。（4）要选用无毒，不易燃烧的价廉易的溶剂。第三节生物活性物质的浓缩与干燥一、生物活性物质的浓缩（一）盐析浓缩硫酸铵沉淀蛋白质（二）有机溶剂沉淀浓缩在生物大分子的水溶液中，逐渐加入乙醇