免疫组化理论课

免疫组织化学基本技术（2）

武汉大学基础医学院病理学教研室

薛敬玲副教授免疫组化技术操作并不困难，虽然染色过程包括很多步骤，但只要注意一些主要问题，就能完成一张质量好的免疫组化切片。内容1.染色前需注意的问题2.染色中需注意的问题

3.如何进行科研设计免疫组化基本流程以石蜡组织为例sp法：

取材---固定---脱水---透明---浸蜡包埋---切片---烤片---染色开始，脱蜡---入水---修复---阻断内源性过氧化物酶---正常羊血清封闭---一抗---二抗---三抗---显色染色前需注意的问题染色中应注意的问题一、脱蜡和水化

免疫组化的脱蜡步骤与常规H&E脱蜡步骤相同，免疫组化实验室中脱蜡需与H&E常规脱蜡分离，以保证脱蜡彻底，否则可能导致染色结果的异常。二、抗体选择

首先确定一抗种属来源能否适应标本来源（人或动物组织），能否适应标本处理形式（冰冻、石蜡），一抗单克隆抗体（鼠、兔）和多克隆抗体（兔、马、羊等）及二，三抗的配套连接，不同方法连接方式不同（S-P、二步法等），购买商品化抗体应尽量购买原液，质量高，保存时间长，而即用型抗体则现买现用，不可长期保存。多抗和单抗的比较均一性，单抗的均一性很强稳定性，单抗的稳定性较差特异性，单抗的特异性强重复性，单抗的重复性好主要有两大类：1、多克隆抗体：为针对多个抗原决定簇的抗体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。2、单克隆抗体：为一个B淋巴细胞分化增殖产生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异性强。抗体的稀释方法直接测定法从以上结果分析，可以选择1:200~1:400之间的浓度

抗体的最佳稀释度

由于各种抗体效价不同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况作适当的调整，以取得中等阳性稀释度为最佳，因其既适合于抗原性强和含量多的标本，也可用于抗原性弱的标本。抗体滴片技术

所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。要领：甩净组织周围的水。抗体滴片图示：三、抗原修复

常规甲醛固定的石蜡切片标本在固定过程中会形成醛键，导致蛋白交联封闭了组织中的部分抗原决定簇，染色前需进行处理，打开醛键暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以使抗体和抗原最大限度结合，提高免疫组化检测阳性率，达到能真实反映该组织蛋白表达水平或抗原含量。抗原修复有酶消化、微波修复、高压处理等。

1、微波修复

本实验室微波修复应用最多，特点是简单、有效，主要根据微波发射高频能量，组织经微波幅射后，会加速组织内部分子高速运动，抗原可完全被暴露出来，用于浆或部分核抗原，膜抗原不用或短时间应用。在0.01MPH6.0柠檬酸缓冲液微波修复时，温度控制在95-100℃之间维持10分钟，不足或超过100℃达不到抗原修复最佳效果。子宫内膜PR染色，修复良好子宫内膜PR染色，修复不足2、酶消化

其作用是以化学的方式使醛键断裂，暴露抗原决定族，增加细胞和组织的通透性，以便抗体与抗原最大限度的结合，增强特异性染色，避免非特异性染色，注意有些抗原显示必须先行消化，有些不需要反而破坏抗原性，使阳性率下降，须消化的组织或细胞抗原，也要视抗原在切片中的封闭程度而定。对某些组织抗原经一种酶消化后，可能结果仍不理想，此时可采用双消化法，消化的时间与固定的时间成反比。胰蛋白酶，用于胞浆抗原，此酶较温和，浓度及消化时间易控制，常用0.05%~0.1%,PH7.8,37℃消化20~30′或更长，微波37℃可短时消化。胃蛋白酶，用于间质抗原，常用0.2%PH2.5左右，消化20~30′或更长，消化后切片应充分洗涤，否则对组织中抗原会进行缓慢消化，破坏组织结构3、高压处理家用压力锅，大小尺寸根据需要而定，1000W电炉，多用于核抗原修复，针对微波修复多阴性，进行高压处理为阳性，如p27、p21WAP1、PR、Ki67效果好。将1500ml~3000ml的柠檬酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。加热处理后免疫组化的染色敏感度大幅度地提高，其机理推测可能是加热打开了组织抗原因福尔马林固定所引起的抗原决定簇的交联，但机理目前仍然还不是十分清楚。4.抗原修复液的选择

加热抗原修复缓冲液有多种，如柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）,Tris(pH7-8),EDTA(pH8.0)等,目前首选柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），优点是染色背景清晰，适合于大多数抗体,Tris和EDTA两种修复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。值得注