微生物学实验-1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色

微生物学实验微生物学实验应当掌握1、微生物的观察方法（制片、染色、油镜的使用）2、微生物的培养方法（培养基配制、分装、包扎、灭菌）3、无菌操作技术（火焰灭菌、倒平板、划线、涂平板、接种）本课程的成绩考核：基础实验：60%由单个实验的成绩相加组成。每次实验由实验指导老师根据出勤、实验操作、实验报告等进行评定，具体比例为：实验出勤及实验态度占20％；实际操作30％；实技能考核30％；实验报告占20％。自主设计实验：40%设计实验方案实验操作总结实验一

细菌的革兰氏染色

实验目的

实验原理

实验材料

实验方法实验结果

注意事项

实验报告

思考题微生物学实验-11.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。2.学习并掌握革兰氏染色技术，进一步熟练光学显微镜油镜的使用技术。实验目的革兰氏染色法（Gramstaining）是微生物学中常用的一种染色方法，该染色法由丹麦医生（ChristianGram）于1884年创立，故名。实验原理G+细菌G-细菌革兰氏染色机理

G+细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，因不含脂类，故乙醇处理不能在壁上溶出缝隙，因此，结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其细胞内，使其呈现紫色。

G-细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它的类脂含量高，所以当乙醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大的缝隙，结晶紫与碘的复合物极易被溶出细胞壁，因此，通过乙醇脱色后，细胞又呈无色。这时再经番红复染，就使G-细菌染成红色，而G+细菌仍呈紫色。结晶紫初染全部细胞紫色碘液媒染全部细胞紫色乙醇脱色G-菌无色G+菌紫色

番红复染G-菌红色G+菌紫色革兰氏染色各步骤时细菌的外观结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色番红复染结晶紫碘液乙醇番红菌种大肠杆菌（Escherichiacoli）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）试剂：

蒸馏水；草酸铵结晶紫染液；卢戈氏碘液

95%乙醇；番红复染液；香柏油；二甲苯光学显微镜实验材料革兰氏染色操作步骤水洗干燥镜检（油镜）涂片滴水取菌火焰固定结晶紫染色1分钟水洗碘液1分钟乙醇脱色（20~30秒） 水洗番红1分钟水洗实验方法自然干燥E.coliS.aureus混合菌涂片方法示意图分辨率D=——数值孔径NA＝n×sin—an=1.515空气n=1λ2NA2a电源电源显微镜油镜的使用与保护插上电源插头，打开显微镜电源开关。调节显微镜光源。先用低倍镜、高倍镜查找标本视野，下降载物台约2cm，加香柏油一滴于标本的待检部位，换用油镜观察。换用油镜后，眼睛从侧面注视油镜头，缓慢上升载物台至油圈不再扩大为止，此时镜头几乎与装片接触，但不可压及装片。观察标本时，双眼同时挣开，左眼观察，右眼画图。油镜用毕，转动粗调将载物台下降，取下标本，用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦净，然后再用擦镜纸擦去二甲苯。7.使各部分还原，物镜镜头呈八字形，光源强度调至最暗，关闭电源，罩上防尘罩，收拾干净台面。金黄色葡萄球菌(G+)大肠杆菌(G-)实验结果大肠杆菌(G-)和金黄色葡萄球菌(G+)注意事项1.涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；自然干燥后再进行火焰固定（以玻片不烫手为宜）。2.染色过程中勿使染色液干涸。3.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，会使阳性菌被误染成阴性菌。4.选用培养18~24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使会使革兰氏阳性菌转成阴性反应。实验报告Escherichiacoli

10×100Staphylococcusaureus

10×100混合菌10×1001．通过本实验你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？思考题实验二

口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用