高通量虚拟筛选(HTS)与药物先导物的发现课件

高通量虚拟筛选

与药物先导物的发现连智慧高通量虚拟筛选

与药物先导物的发现连智慧1主要内容高通量虚拟筛选策略与方法高通量虚拟筛选应用实例基于药效基团的数据库搜寻基于分子对接的虚拟筛选方法高通量虚拟筛选的一般流程虚拟筛选在先导化合物发现中的应用主要内容高通量虚拟筛选策略与方法高通量虚拟筛选应用实例基于药2需要区分的三个概念高通量筛选虚拟筛选高通量虚拟筛选需要区分的三个概念高通量筛选虚拟筛选高通量虚拟筛选3高通量虚拟筛选策略与方法分子识别：大部分药物通过与特定的酶或受体等靶标结合而起作用，这种结合就叫做分子识别最通常的例子是酶与底物、激素与受体、配体与受体以及抗原与抗体等之间的结合配体与受体的识别理论是虚拟筛选，甚至整个药物设计方法的基础高通量虚拟筛选策略与方法分子识别：大部分药物通过与特定的4基于小分子的结构—反映与靶标分子互补的关键结构特征

—间接反映小分子与靶标的作用高通量虚拟筛选策略与方法基于分子对接进行的虚拟筛选

基于药效团进行的虚拟筛选基于受体的结构——直接反映小分子与靶标的结合基于小分子的结构—反映与靶标分子互补的关键高通量虚拟筛5高通量虚拟筛选策略与方法高通量虚拟筛选策略与方法6高通量虚拟筛选策略与方法基于药效基团的数据库搜寻药效基团通常是那些可以与受体结合点形成氢键相互作用、静电相互作用、范德华相互作用和疏水相互作用的原子或官能团药效基团连同其空间关系称为三维药效基团。三维药效基团模型的构建方法一般有两种：通过对一组具有生物活性的化合物进行结构活性关系的分析，找出其相同的特征结构来建立的通过对活性化合物与其靶标的复合物晶体结构进行分析来得到三维药效基团模型高通量虚拟筛选策略与方法基药效基团通常是那些7高通量虚拟筛选策略与方法评价方法费用函数NullcostFixcostTotalcost得到药效基团模型后，即可将其作为提问结构的模板，对小分子化合物数据库进行搜寻，筛选出符合药效基团要求的分子，在虚拟筛选里，即认为这些符合要求的分子就是高活性的分子。然后再对由药效基团确定的化合物进行药理测试基于药效基团的数据库搜寻CatScramble——confidencelevel交叉验证测试集的验证高通量虚拟筛选策略与方法评价方法费用函数Nullcost8高通量虚拟筛选策略与方法基于药效基团的数据库搜寻基于药效团的虚拟筛选的一般流程高通量虚拟筛选策略与方法基基于药效团的虚拟筛选的一般流程9高通量虚拟筛选策略与方法基于分子对接的虚拟筛选方法首先要建立大量化合物（靶标生物大分子和小分子）的三维结构数据库，然后将库中的分子逐一与靶标分子进行“对接”，通过不断优化小分子化合物的位置和构象寻找小分子化合物与靶标大分子作用的最佳构象，并对其进行打分。在库中所有分子均完成对接计算之后，即可从中找出与靶标分子结合的最佳分子（前50名或前100名）。要求库中的化合物具有足够的分子多样性高通量虚拟筛选策略与方法基首先要建立大量化合10高通量虚拟筛选策略与方法基于分子对接的虚拟筛选方法现在应用于分子对接的打分函数基于回归的参数基于知识的打分函数——根据已知复合物结构，计算作用力统计值基于力场的打分函数——以分子间作用力表达，忽略熵变应用较普遍一致性打分——以不同方法分别打分，统计出打分值排名对于以虚拟筛选为目的的打分函数，能够区分活性化合物和非活性化合物是最重要的，并无必要正确的对活性化合物进行排序不同的打分函数应用于不同的体系，对不同体系的效果并不相同高通量虚拟筛选策略与方法基现在应用于分子对接的打分函数基于回11高通量虚拟筛选策略与方法基于分子对接的虚拟筛选方法改进之处——降低假阳性问题分子对接需要改进的地方有三个方面：打分函数、考虑生物大分子柔性和溶剂化效应打分函数是不考虑溶剂化效应的，或是先产生真空构象。然后用一个包含溶剂化效应项的打分函数进行排序现在大部分分子对接程序都考虑小分子的柔性，而把大分子当作是一个刚体，就会限制药物设计的小分子类型对于大分子柔性现有的研究结果

只考虑生物大分子的侧链的柔性对结构没有改善利用生物大分子不同的静态结构来考虑其柔性可能会成为一个主要的方法，特别是那些引起生物大分子不同结合构象的小分子高通量虚拟筛选策略与方法基改进之处——降低假阳性问题分子对接12高通量虚拟筛选策略与方法基于分子对接的虚拟筛选方法基于分子对接的虚拟筛选的一般流程Or同源蛋白模建可以减少计算量Or软件转换ABCDADME—约40%失败高通量虚拟筛选策略与方法基基于分子对接的虚拟筛选的一般流程O13同源蛋白模建法•根据已知的蛋白质三维结构来预测可能的三维结构——基于知识的预测•同源蛋白有着相似的来源、相似的结构和生物功能。通过比较蛋白序列的相似性，按同源蛋白的三维结构为模板，构建未知蛋白的结构•一般要求同源性在30%以上，特别是在结合区域同源性要好同源蛋白模建法14（1）根据未知蛋白质的序列，寻找同源蛋白（2）二重或多重序列对比（3）找出共同的二级结构区域，构建骨架（4）对初始模型作能量优化（5）判断结构合理性同源蛋白模建法步骤：（1）根据未知蛋白质的序列，寻找同源蛋白同源蛋白模建法步骤：15高通量虚拟筛选策略与方法基于分子对接的虚拟筛选方法确定结合口袋的方法大多数情况下可以根据生物大分子与小分子的复合物结构来确定在没有复合物结构的情况下（多数情况是没有受体的结构），要根据生物大分子的结构、功能以及定点突变的实验结果，进行手动确定结合口袋现在有一些算法（如SiteID），可用以确定生物大分子的结合口袋高通量虚拟筛选策略与方法基确定结合口袋的方法大多数情况下可以16高通量虚拟筛选策略与方法基于分子对接的虚拟筛选方法分子对接—虚拟筛选的核心步骤分子对接利用系统搜寻、禁忌搜索、模拟退火和遗传算法等将库中的分子逐一放置在靶标生物分子的结合部位，并通过不断优化小分子化合物的位置、取向以及构象，来寻找小分子化合物与靶标大分子作用的最佳构象，并对其进行打分高通量虚拟筛选策略与方法基分子对接—虚拟筛选的核心步骤17高通量虚拟筛选策略与方法基于分子对接的虚拟筛选方法分子对接—虚拟筛选的核心步骤禁忌搜索—模拟退火—遗传算法是解决搜索问题的一种通用算法搜索算法的共同特征为：①首先组成一组候选解；②依据某些适应性条件测算这些候选解的适应度；③根据适应度保留某些候选解，放弃其他候选解；④对保留的候选解进行某些操作，生成新的候选解只搜索未访问过的区域（已访问解的禁忌链条）—寻找全局最优值一般需要105～106步将小分子的熵值设置在最大，通过不断降低熵值，寻找最佳构象遗传算法—高通量虚拟筛选策略与方法基分子对接—虚拟筛选的核心步骤禁忌搜18高通量虚拟筛选策略与方法基于分子对接的虚拟筛选方法分子对接的后处理主要是对化合物进行ADME/Tox（吸收、分布、排泄以及毒性）评价，以判断化合物是否是类药（drug-like）分子，并过滤掉非类药分子。根据5规则等经验规则和计算方法，以预测分子的体积、表面积、偶极矩以及疏水性等物理化学性质，代谢性质和毒性等性质，先将化合物数据库中的非类药性分子过滤掉，从而可以节省虚拟筛选的耗时高通量虚拟筛选策略与方法基分子对接的后处理主要是19高通量虚拟筛选策略与方法进行虚拟筛选的目的使得从选定的子集中比在随机挑选出来的化合物中更容易发现活性化合物（富集率）高通量虚拟筛选策略与方法进行虚拟筛选的目的使得从选定的子集中20高通量虚拟筛选应用实例雌激素受体激动剂和拮抗剂背景

雌激素手提中于激动剂想结合的关键螺旋被拮抗剂侧位的特征取代基推开雌激素受体—核受体家族中的一种。与激动剂结合以后，配体结合部位附近的结构会发生变化，从而促使受体与其识别蛋白结合。然后转运到细胞核内，与DNA结合调控基因的表达与拮抗剂结合以后，其结构也会发生变化，但不会产生类似的效应。实例一高通量虚拟筛选应用实例雌背景雌激素受体—核受体家族21高通量虚拟筛选应用实例雌激素受体激动剂和拮抗剂靶标生物大分子激动剂结构的受体——雌激素受体与雌二醇复合物的晶体结构拮抗剂形式的受体——雌激素受体与雷洛昔芬复合物的晶体结构分子对接前——利用InsightⅡ软件对晶体结构进行必要的修饰：加氢，将距离配体1.5nm以内的残基定义为结合口袋，并进行限制性优化实例一高通量虚拟筛选应用实例雌靶标生物大分子激动剂结构的受体——雌22高通量虚拟筛选应用实例雌激素受体激动剂和拮抗剂小分子数据

—MDL公司的ACD-SC数据库的150万种化合物数据库预处理校正二维结构，在生理PH条件下进行质子化处理，计算理化性质二维性质过滤，删除无机化合物和非类药性分子。利用MSIConverter软件将二维结构转化为三维结构通过以上处理得到110万个类药性分子的三维结构加入一些已知的配体（参考活性分子），以测试分子对接是否能从一大批随机的化合物中找出已知的活性化合物实例一高通量虚拟筛选应用实例雌小分子数据数据库预处理校正二维结构，23高通量虚拟筛选应用实例雌激素受体激动剂和拮抗剂选定的子集进行虚拟筛选的目的是使得从选定的子集中比在随机挑选出来的化合物中更容易发现活性化合物富集率为取样中发现参考化合物的比率与随机样品集合中发现参考化合物的比率之比实例一高通量虚拟筛选应用实例雌选定的子集进行虚拟筛选的目的是24高通量虚拟筛选应用实例雌激素受体激动剂和拮抗剂分子对接分子对接程序——自制程序PRO-LEADS小分子是柔性的，生物大分子是刚性的采用禁忌搜索打分函数——采用能量函数修正——增加一个长程氢键作用项以及关于配体、受体碰撞和配体张力能项ChemScore辅助描述符——主要增加形状互补、配体与受体的极性和非极性表面匹配等有关描述符实例一高通量虚拟筛选应用实例雌分子对接分子对接程序——自制程序PR25可以直接预测结合自由能打分是基于配体与受体的作用强度，以及结合对配体的柔性的影响所导致的熵效应。配体与受体的相互作用又以氢键接触、亲脂接触以及金属结合的几何构型来表征。通过预先计算相应的网格文件，可以加快虚拟筛选时的计算速度高通量虚拟筛选应用实例雌激素受体激动剂和拮抗剂分子对接——能量函数ChemScore可以直接预测结合自由能打分是基于配体与受体的作用强度，以及结26高通量虚拟筛选应用实例雌激素受体激动剂和拮抗剂分子对接——结果

参考活性分子——所预测的参考分子与雌激素受体的结合模式与已知的晶体结构数据时一致的

参考分子的测试结果20个已知激动剂20个已知拮抗剂实例一高通量虚拟筛选应用实例雌分子对接——结果参考活性分子—27高通量虚拟筛选应用实例雌激素受体激动剂和拮抗剂激动剂受体对接结果100万化合物中，只有1%的结合能低于-40KJ/mol已知激动剂（配体）的结合能在-33～-46KJ/mol之间类固醇配体结合能在-41～-46KJ/mol之间，非类固醇配体得分较差根据预测的结合活性可以很好地区分配体与随机挑选的化合物实例一高通量虚拟筛选应用实例雌激动剂受体对接结果100万化合28高通量虚拟筛选应用实例雌激素受体激动剂和拮抗剂激动剂受体对接结果已知拮抗剂的结合能在-44～-62KJ/mol之间，与随机化合物区分度很好100万化合物中，只有1%的结合能达到相似水平实例一高通量虚拟筛选应用实例雌激动剂受体对接结果实例一29高通量虚拟筛选应用实例雌激素受体激动剂和拮抗剂虚拟筛选的进一步验证在分子对接得分较高的化合物中选出一些进行进一步的过滤然后排除结构有问题的化合物，激动剂最后得到120个化合物拮抗剂得到37个化合物实例一高通量虚拟筛选应用实例雌虚拟筛选的进一步验证在分子对接得分较30高通量虚拟筛选应用实例雌激素受体激动剂和拮抗剂虚拟筛选的进一步验证用虚拟筛选最后得到的化合物与人的雌激素受体进行结合活性测定实例一高通量虚拟筛选应用实例雌虚拟筛选的进一步验证用虚拟筛选最后得31高通量虚拟筛选应用实例雌激素受体激动剂和拮抗剂测试结果说明:虚拟筛选可以从各种各样的结构中找到潜在的激动剂和抑制剂实例一高通量虚拟筛选应用实例雌测试结果说明:实例一32高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二背景PTB-1B是发现糖尿病药物的重要靶标PTB-1B能够催化水解胰岛素受体中的磷酸化络氨酸，使得胰岛素受体失活，Ⅱ型糖尿病的发作涉及到PTB-1B的过量表达PTB-1B有两个结合位点：

具有催化活性的位点没有催化活性的位点高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二背景PT33高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二部分利用单浓度测试对40万个化合物进行分析对PTB-1B的抑制活性达到300μmol/l则认为值得进行进一步的而研究

第一部分：实验筛选高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二部分34第二部分：虚拟筛选利用分子对接对2.3万化合物进行虚拟筛选对PTB-1B的抑制活性达到200μmol/l，则认为值得进行进一步的而研究

高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二部分第二部分：虚拟筛选利用分子对接对2.3万化合物进行虚拟筛选高35第三部分：抑制活性测试——IC50测试，一个化合物的IC50低于100μmol/l，则认为它“命中目标”高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二部分第三部分：抑制活性测试——IC50测试，高通量虚拟筛选应用36高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二部分第四部分：比较高通量筛选和分子对接对两批活性化合物进行多样性和类药性分析高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二部分第四37高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二部分第一部分：实验筛选——单浓度测试第二部分：虚拟筛选抑制活性测试——IC50测试第三部分：第四部分：比较高通量筛选和分子对接高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二部分第一38高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二实验筛选在40万个化合物中，有543个化合物在300μmol/l浓度能够明显抑制PTB-1B单浓度测试抑制活性测试单浓度测试中的543个化合物中85个化合物的

IC50介于100μmol/l～1μmol/l之间，命中率为0.021%高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二实验筛选39高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二

虚拟筛选主要考虑要点：分子是否同时与晶体结构中的两个位点作用，同时与两个位点作用，将有助于提高其活性分子中是否有羧基在选定365个化合物中，178个同时与两个位点作用

187个化合物只于一个位点作用——889个分子进行分析高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二虚拟筛40高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二

虚拟筛选——抑制活性测试在365个化合物中，127个IC50值低于100μmol/l

命中率达34.8%，

21种化合物的IC50达到10μmol/l最好的化合物的IC50为1.7μmol/l

高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二虚拟筛41高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二实验筛选与虚拟筛选的比较分子对接的命中率是高通量筛选的1700倍比较——说明分子对接能够淘汰那些不大可能抑制PTB-1B的化合物，使得能够集中力量研究那些比较可能与PTB-1B结合位点作用的化合物高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二实验筛选42高通量虚拟筛选应用实例蛋白络氨酸磷酸酯酶抑制剂实例二实验筛选与虚拟筛选的比较——类药