益气健脾中药对脾胃模型大鼠一氧化氮信号通路及胃泌素水平的影响

益气健脾中药对脾胃模型大鼠一氧化氮信号通路及胃泌素水平的影响

结果表明，氧化氮合酶（nos）广泛分布于胃肠道。其产物一氧化氮（no）是非类固醇，具有抑制胆碱能神经的功能，广泛参与胃肠道的生理功能。NO不仅在神经传导、胃肠保护中起重要作用,而且参与多种病理发生的信号转导。胃泌素(GAS)属胃肠激素,分布于中枢神经系统和胃肠道黏膜组织,在外周作为激素调节胃的运动功能,属兴奋胃肠运动的脑肠肽之一。而中医脾虚证出现如纳呆、腹胀、大便溏结不调等症状均为胃肠道生理功能紊乱所致,故本课题以脾气虚证大鼠为对象,研究一氧化氮信号通路及GAS表达水平在脾气虚证进程中的动态变化以及益气健脾中药的干预效应,以期揭示脾气虚证发生的内在机制。1实验材料1.1动物熔剂scxkSPF级Wistar大鼠,雌雄各半,3月龄,体质量(180±20)g,甘肃中医学院医学实验中心提供,动物合格证号SCXK[甘]2011实验设施合格证SYXK[甘]20111.2浓缩-制备工艺中药均购自兰州复兴厚中药材有限责任公司。益气健脾中药(四君子汤)以人参、白术、茯苓、甘草按3∶3∶3∶2比例配制,加10倍量蒸馏水浸泡4h,按常法煎煮2次,每次40min,滤出药液,置70~80℃水浴浓缩至每1mL药液含原药材2g,冷却后置4℃冰箱备用,使用时稀释至所需浓度。大黄制剂:将生大黄饮片碎成粉,用蒸馏水浸泡,置于50℃水浴6h,去渣取汁4℃保存。考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(批号20101214)、NO测试盒(批号20101215)、NOS测试盒(批号20101216),南京建成医学生物研究所产品;GAS放免试剂盒(批号20101221),北京北方生物技术研究所产品。1.3u3000治疗kh-4、ft-400g的仪器DF110型电子分析天平,721型可见光分光光度计,HH-4数显恒温水浴箱,XYJ80-2离心机,FT-630g微机多探头γ计数器,KDC-2044低速冷冻离心机。2实验方法2.1模式1不同性别组适应性饲养1周后,受试动物按体质量编号,用随机数字表法分为正常对照组、模型组(7、14、21d)、益气健脾组,每组10只,雌雄各半分笼饲养。参考文献方法,以大黄法、力竭法及饥饿法三因素复合法复制脾气虚证模型,共21d。2.2灌胃剂量及灌胃容积造模同时益气健脾组给予益气健脾中药灌胃给药干预,灌胃剂量20g/(kg·d),灌胃容积为1mL/100g体质量,连续3周;空白对照组、模型组给予同体积蒸馏水灌胃。各组均以蒸馏水、标准饲料喂养。2.3nos检测方法造模时分别于第7、14、21日末取材并制备待检样本。各组大鼠于末次灌胃给药后,禁食不禁水24h,测体质量作记录,采血后断头处死并制备待检标本。血清制备:股动脉取血4mL,静置2h后,2000r/min离心10min,取上清,放入尖底管中4℃低温冰箱保存待测,一部分采用比色法检测NO、NOS,一部分采用放免法检测GAS。胃、小肠组织的收集:动物处死后,迅速将近胃小弯胃组织、胃窦端小肠组织截取,称重后分别用眼科小剪刀尽快剪碎,分别置于匀浆器中,用组织重9倍生理盐水匀浆(匀浆器的末端置于放冰块的冷水中),后以3500r/min离心10min,取上清液置4℃冰箱保存,其中胃、小肠组织匀浆上清液一部分采用比色法检测NO、NOS,胃组织匀浆一部分采用放免法检测GAS。3两组间样本均数差异的比较采用SPSS13.0软件进行统计分析,实验数据以—x±s表示,组间样本均数差异的比较选用F检验,在F检验有统计学意义时,再用q检验进行两两比较,P<0.05表示差异有统计学意义。4结果4.1益气健脾对大鼠的影响正常对照组大鼠始终表现为反应灵敏,活动及饮食量正常,被毛浓密柔顺而有光泽,粪便呈棕褐色颗粒状。模型组大鼠多数在第5日即开始出现倦卧、被毛稀疏干枯;第10日后出现少食、怠动、消瘦、肛周污秽,部分动物出现脱肛,动作迟缓,甚至行动歪斜,同时毛发失去正常光泽而枯槁、疏散,而后出现畏寒,成群蜷缩或拱背,并逐渐出现体质量减轻,大便增多(垫料呈橘黄色)等脾虚症状。益气健脾组大鼠第6日出现轻度倦卧、被毛稀疏干枯;第13日后出现少食、怠动、消瘦、肛周污秽,少部分动物出现脱肛,动作迟缓,大便增多等;第16日后上述症状开始减轻或消失,表现为反应较为灵敏,活动及饮食量正常,被毛疏散但有光泽,粪便部分呈颗粒状。4.2益气健脾益气对脾虚证大鼠血清和胃肠组织氮含量的影响见表14.3益气健脾益气益气对脾虚证大鼠血清和胃肠组织氮氮酶含量的影响见表24.4益气健脾，中医对脾虚证大鼠血清和胃肠组织中的胃素含量的影响见表35nos及gas脾虚证作为一种全身性的病理状态存在着胃肠道运动功能紊乱,消化吸收功能下降,淀粉酶活性下降及其化学消化能力低下,胃排空加速,小肠吸收功能下降;同时胃肠道内分泌及激素异常,餐后血清GAS明显降低,G细胞合成分泌功能减弱,由此提示脾虚证的发生可能有细胞信号转导通路的参与。四君子汤是益气健脾法的代表方剂,方中人参性甘大补脾胃之气为君;白术苦温,助君药燥湿健脾;茯苓甘淡健脾、渗湿利水;炙甘草味甘性微温,和中益气。四药相辅,具有益气健脾之功效。研究表明,NOS广泛分布于胃肠道,其产物NO是非肾上腺素能非胆碱能神经的抑制性递质,广泛参与胃肠生理功能。NO为一种双功能物质,不仅参与机体多个系统、多种细胞的多种生理作用,并且也参与多种疾病发生发展的病理过程。NO是一种活性很强的无机自由基气体,具有氧化还原特性。此外,NO对胃动力的影响是一个抑制性过程,具有延缓胃排空功能,已有研究发现,胃平滑肌细胞和胃肌间神经丛含有大量的NOS,说明机体对NO的调节主要是通过NOS来实现的。GAS属胃肠激素,主要由胃窦组织及十二指肠黏膜开放型G细胞分泌,分布于中枢神经系统和胃肠道黏膜组织,在中枢神经系统作为神经递质,在外周作为激素调节胃的运动功能,属兴奋胃肠运动的脑肠肽之一,而且具有刺激胃底腺分泌、增加胃泌酸区黏膜血流量、促进胃肠道黏膜细胞分裂增殖作用,对维持胃黏膜正常的组织结构和生理功能很重要。本研究结果显示,脾气虚7、14、21d组大鼠血清、胃、小肠组织NO、NOS及GAS含量随着造模周期延长而持续降低,以21d组显著;而益气健脾组大鼠血清、胃、小肠组织NO、NOS及GA