小鼠脾虚便秘模型的建立及d-木糖含量测定

小鼠脾虚便秘模型的建立及d-木糖含量测定

便秘是指排便次数的减少，大便不畅、疲劳、困难，大便干燥和困难。这不仅是一种疾病，也是其他疾病的常见并发症。随着饮食结构、疾病谱的变化,以及精神心理和社会因素对疾病的影响,便秘的发病率逐渐增加,我国成年人群便秘患病率约为3%~17%。本文采用复合因素的方法建立小鼠脾虚便秘模型,旨在探讨便秘的发病以及中药治疗机制。1材料表面1.1实验动物及饲养环境清洁级SPF昆明小鼠105只,雌雄各半,体重(20±2)g,由广东医学院动物中心提供(合格证号:2006A028),饲养于广东医学院实验动物中心,常规饲养7天以适应环境。1.2样品及饮料的制备取番泻叶500g,加10倍量沸水浸泡10min,滤过,将滤液在75℃水浴中蒸发浓缩成100%(每升含1kg生药)的水煎液。白术、枳实按2:1比例组成,先浸泡30min,按1:10比例加蒸馏水,电炉文火煎煮40min,沙布过滤,滤渣加6倍量清水,文火煎煮40min,纱布过滤,合并两次煎液。将滤液在75℃水浴中蒸发浓缩成100%的水煎液。以上中药均购自广东医学院附属医院药房。便秘通口服液:广州中一药厂生产,批号:97040013。D-木糖液的制备:上海伯奥生物科技有限公司,用蒸馏水按3%比例配制。血清D-木糖试剂盒:南京建成生物有限公司。2方法2.1造模、养焦、饮水将小鼠雌雄分笼饲养,保持适宜的环境(室温23℃~25℃,相对湿度50%~70%,清洁安静),适应性喂养7天后开始造模。具体步骤如下:第1天~7天,造模组用番泻叶按0.8ml/d灌胃,正常饮食饮水,造成脾虚模型;第8天起停用番泻叶,采用饥饱失常方法延续脾虚状态。隔天喂低纤维饲料生大米4~8g,自由饮水1次,每次0.5h。在脾虚模型的基础上,采用限制饮水和控制饮食方法造成便秘模型,造模时间共15天。2.2前药剂量计算造模前随机设正常对照组15只和造模组90只。造模成功后将造模组小鼠再随机分为模型组,枳术丸大、中、小剂量组,便秘通组,蒸馏水组。按正常成人与小鼠给药剂量系数折算,根据公式:小鼠剂量=W×人剂量(W为小鼠与人的折算系数),计算出小鼠每日给药剂量,枳术丸按大(2倍于临床等效量)、中(临床等效量)、小(0.5倍于临床等效量)三个剂量给药,相当于含生药量分别为18、9和4.5g/kg。便秘通按中剂量(临床等效量)给药,给药量为6mL/kg。蒸馏水按中剂量给药,给水量为6mL/kg。2.3观察小鼠的变化实验期间,每日观察、记录各组大鼠的食量、体质量、粪便等情况。2.4大传统中大鼠的解剖小鼠外观干瘪、瘦小、竖毛、拱背、活动减少,体重减轻,大便干结、数量减少、颗粒细小;解剖见大便集结在结肠,呈球状或串珠状,空肠、回肠无明显粪便残留;肠道推进率和血清D-木糖水平降低。2.5方法模型组模型第17~24天,除正常对照组外,各组小鼠每天喂生大米4~8g,自由饮水1次,每次0.5h。除模型组外,各组小鼠分别用枳术丸汤剂大、中、小三个剂量及便秘通、蒸馏水对照治疗。第24天后动物实验结束,进行各项指标检测。2.6肠道长度和活性炭混悬液推进长度测定造模成功及治疗组停药后,禁食禁水24h,给小鼠灌D-木糖液40min后经口灌入活性炭悬液0.1ml/10g(悬液浓度100g/L),20min后眼球取血处死,立即剖腹取出幽门到直肠末段的全部肠道,在无张力状况下测量肠道全长及活性炭混悬液在肠道内推进长度,并计算活性炭悬液推进长度占肠道全长的百分比(黑染肠管长度/肠管总长度)。2.7小鼠3.d-木糖溶液的配制禁食24h,按10ml/(kg·d)剂量给予小鼠3%D-木糖溶液灌服,1h后眼球取血。离心制备血清,按照D-木糖试剂盒说明书所述,应用比色分析法测定各组小鼠血清D-木糖含量。2.8多样性均数拟合采用SPSS13.0统计软件进行分析,计量资料用(x±s)表示,多样本均数比较用单因素方差分析,先进行方差齐性检验,当方差齐时用Bonferroni法进行比较,当方差不齐时用Tamhane’sT2法。3结果3.1各组大鼠前病理情况比较(1)正常对照组:眼睛有神,活动快速,背毛浓密而有光泽,饮食、饮水适中,大便正常。(2)模型组:造模第3天大鼠开始出现竖毛、背毛失去光泽、拱背、活动减少、继之、被毛枯槁、倦卧、嗜睡、四肢无力、便塘、肛周污秽、进食量减少、消瘦、干瘪,造模第10天后出现便秘症状,大便数量减少、颗粒变小、质硬且上述脾虚症状持续存在。解剖见大便集结在结肠,呈球状或串珠状,空肠、回肠无明显粪便残留。(3)各治疗组:治疗后第4天起,一般情况逐渐好转,进食量增多、活跃、便秘症状消失,大便数量增多、颗粒大、质软。(4)蒸馏水组:小鼠消瘦,干瘪,背毛无光泽、活动不多、进食量少、大便干结、数量少、颗粒小、质硬,脾虚和便秘的症状均无明显改善。3.2比较各组大鼠的实验指标各组小鼠实验指标比较见表1。4项目研究的结果目前的便秘模型主要有燥结失水模型、气虚模型、阳虚模型、复方地芬诺酯模型,但是对既与病因病机相符合,又能体现与“证”相似的主要症状的中医证型的便秘模型的研究尚少。我们在分析和总结上述模型研究的基础上,从造模的思路、理论依据、指标观察和药物治疗等几个方面进行了总结和思考,认为在模型的研制上应综合以下三个方面条件:(1)由类似的病因所引起。(2)出现与“病”和“证”相似的症状。(3)结合临床的治疗方案和大体相同的剂量方药治疗有效。用泻剂致脾虚是目前较为经典的脾虚模型造模方法,并且也有学者长期用泻剂的方法来研制慢传输型便秘模型。因此,可以说泻剂在脾虚便秘模型的研制中是唯一的选择,既切合脾气虚,又可符合便秘的病理改变。我们在前期造模过程中,首选番泻叶造成脾虚模型,同时综合考虑了便秘的发病非单因素所致,如长期饮食减少,对肠道的刺激减少进一步导致肠道的蠕动减慢等因素,且从中医病因病机的角度也认为,饥饱失常可以导致脾虚。因此,综合上述理论基础,采用饥饱失常、限制饮食的方法继续施加脾虚因素,同时予以限制饮水和低纤维饮食等方法造成便秘模型,应用多因素造模方法研制成脾虚便秘模型,即能符合便秘的发病原因,又能客观地体现中医“证”的特点。本实验结果可见,模型组小鼠出现了脾虚和大便干结的表现,既具有脾虚的证的特点,又具备了便秘症状,说明本模型复制的方法是符合中医病证模型研究思路的。经药物治疗后,小鼠脾虚和便秘的症状均有所缓解,体重增加,尤其以枳术丸大、中剂量组效果最明显,而蒸馏水组则无明显改善。客观指标与证具有密切的相关性,是疾病诊断的客观依据,因此选择与本证相关性高且较全面的实验指标是必不可少的。肠道推进性运动是胃肠平滑肌在神经、体液因素调节下电活动、机械活动协调的结果,因此检测肠道推进功能可以准确地反映胃肠动力状态;血清D-木糖吸收率是验证脾虚的经典指标