高效液相色谱法测定苯甲酸阿格列汀片的含量

高效液相色谱法测定苯甲酸阿格列汀片的含量

苯乙烯-金属丝是日本拿达公司开发的一种丝氨酸酶诱导剂（dpp-a），它可以维持体内胰高血糖素1（glp-1）和葡萄糖对胰岛素浓度（gip）的依赖，促进胰岛素的分泌，发挥抗糖作用。2010年4月该药获得日本厚生劳动省的上市批准,商品名Nesina。苏州大学实验材料供应中心与南京佳核鑫医药科技有限公司目前正在进行苯甲酸阿格列汀原料药和制剂的研究与协作申报,该药属于化学药3.1类新药。由于国外新药的质量标准属于技术保密,目前苯甲酸阿格列汀的含量测定未见有文献报道。为控制该药质量,本文建立了测定苯甲酸阿格列汀片含量的高效液相色谱(HPLC)法,以为该制剂的质量评价和标准建立提供依据。1材料表面1.1紫外-可见分光光度计HPLC仪(LC-10AT泵、SPD-10Avp紫外检测器)、LCsolution色谱工作站、UV-2401PC紫外-可见分光光度计(日本Shimadzu公司)。1.2片的规格规格苯甲酸阿格列汀片(南京佳核鑫医药科技有限公司制剂室,批号:121101、121102、121103,规格:每片25mg);苯甲酸阿格列汀对照品(苏州卡耐博生物技术有限公司,批号:121027,纯度:99.66%);乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯。2方法和结果2.1流动相、纤维素-乙腈kh2po4-磷酸调ph3.0色谱柱:KromasilC18(250mm×4.6mm,5µm);流动相:0.05mol/L的KH2PO4溶液(磷酸调pH3.0)-乙腈(65∶35),流速:1.0ml/min;检测波长:224nm;柱温:室温;进样量:20μl。2.2续滤液的制备供试品溶液:取苯甲酸阿格列汀片剂粉末适量,约相当于苯甲酸阿格列汀10mg,精密称定,置于100ml量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,过滤,取续滤液即得。对照品溶液:取苯甲酸阿格列汀对照品,用流动相溶解并制成每1ml中含苯甲酸阿格列汀100μg的溶液,即得。2.3理论板数和峰形对称精密量取“2.2”项下对照品、供试品溶液各20μl进样,并以空白辅料的流动相溶液作为对照。结果,苯甲酸阿格列汀的理论板数为14654,保留时间为8.433min,峰形对称。色谱详见图1。2.4线性范围的确定取苯甲酸阿格列汀对照品,用流动相溶解并稀释制成苯甲酸阿格列汀质量浓度分别为19.96、59.88、99.80、139.7、179.6μg/ml的溶液。精密量取上述溶液各20μl分别注入色谱仪,记录色谱图。以进样质量浓度(c)为横坐标、苯甲酸阿格列汀的峰面积(A)为纵坐标进行线性回归,得回归方程为A=-6.7598×104+5.7178×104c(r=0.9999)。结果表明,苯甲酸阿格列汀检测质量浓度的线性范围为19.96~179.6μg/ml。以信噪比10计算,测得苯甲酸阿格列汀定量限为2ng。2.5对照品溶液的制备取苯甲酸阿格列汀对照品适量,按“2.2”项下方法制备成对照品溶液,连续进样5次并测定。结果峰面积值的RSD=0.31%(n=5)。2.6样品含量测定精密称取同批样品6份,按“2.2”项下方法制备供试品和对照品溶液,进样20μl,分别测定每份样品的含量。结果平均含量为99.87%,RSD=0.39%(n=6),表明本方法重复性良好。2.7进样、测定取供试品溶液1份,分别于放置0、1、2、4、8、12h时进样、测定。结果以峰面积计算RSD=0.47%(n=6),表明供试品溶液在12h内稳定。2.8对照品回收率取同批样品,按测试浓度的80%、100%、120%分别加入苯甲酸阿格列汀对照品各3份,照“2.9”项下同法操作,计算回收率,结果详见表1。2.9测定项目含量取苯甲酸阿格列汀片剂粉末、对照品适量,按“2.2”项下方法分别制备成供试品、对照品溶液,分别进样测定,记录峰面积,并按外标法以峰面积计算含量。结果3批样品占标示含量百分比分别为99.26%、99.87%、99.39%。3讨论3.1紫外分光光度法前期试验中,取苯甲酸阿格列汀对照品、片剂粉末、空白辅料以及合成各步中间体适量,分别用流动相配制成质量浓度约为10μg/ml的各溶液,按紫外分光光度法操作,于200~400nm波长范围内进行扫描。结果对照品、供试品溶液中的主成分均于224、277nm波长处有最大吸收,合成各步中间体于224nm波长处均有最大吸收,辅料溶液在此处无吸收,故检测波长确定为224nm。3.2流动相条件的验证前期试验中,通过对苯甲酸阿格列汀片(批号:121101)、各中间体及破坏后样品的测定,发现采用常见的水-乙腈(50∶50)为流动相时,主成分峰形不好,很难洗脱出来;采用浓度为0.05mol/L的KH2PO4(未调pH值)溶液-乙腈(65∶35)为流动相时,主成分的峰前延很大;采用浓度为0.05mol/L的KH2PO4(用磷酸调pH3.0)溶液-乙腈(65∶35)为流动相时,阿格列汀的峰形对称,与其有关物质、各步中间体和降解产物均能得到很好的分离。苯甲酸阿格列汀片(批号:121101)在酸、碱、光、热破坏下未见明显降解产物,在氧化破坏下产生明显的降解产物,且与离主成分峰最近的降解产物峰的分离符合要求,表明本法确立的流动相条件合适。色谱结果见图2。3.3