医用高分子壳聚糖的性质与功能

医用高分子壳聚糖的性质与功能

1壳聚糖的制备及降解意义地壳聚糖是广泛使用的自然可降解医疗分子。这是乙酰基含有c的异质结的产物。具有良好的分解性、成膜性、吸附性和生物兼容性。壳聚糖结构与存在于细胞外基质中的糖胺聚糖类似,壳聚糖膜中大量自由氨基的存在使其表面具有很强的吸附作用,有利于细胞的粘附;另外,壳聚糖具有无毒性和免疫原性,能在溶菌酶作用下生物降解,考查其降解产物对细胞行为的影响,对研究壳聚糖作为组织工程支架及其生物相容性意义重大。本文旨在探索不同脱乙酰度壳聚糖的制备工艺及其结构与性能的变化,为最终研究不同脱乙酰度壳聚糖及其降解产物对内皮细胞形成血管的影响做准备。壳聚糖的脱乙酰度(degreeofdeacetylation,缩写为D.D.)可定义为壳聚糖分子中脱除乙酰基的糖残基数占壳聚糖分子中的糖残基数的百分数,根据脱乙酰度不同可将壳聚糖分为高(85%~95%)、中(70%~85%)、低(55%~70%)3类。据文献报导和本课题组前期实验表明,细胞在不同脱乙酰度的壳聚糖膜上的生长活性及细胞行为差异显著,D.D.的变化对壳聚糖相对分子质量、晶体结构、水溶性、成膜性能及降解速率均有影响,因而研究不同脱乙酰度壳聚糖结构与性能的变化,对之后研究不同脱乙酰度壳聚糖降解产物对细胞的影响,建立细胞行为与壳聚糖结构性能的关系有重要作用。不同脱乙酰度壳聚糖可以通过高脱乙酰度壳聚糖进行一系列乙酰化反应制得,但由于反应条件较难控制,国内外研究制备的壳聚糖D.D.多集中在60%~80%以外,因此通过研究相体系的控制、乙酸酐用量等因素,探寻由高脱乙酰度壳聚糖原料制备中、低脱乙酰度壳聚糖的方法是本文研究的重点。2实验2.1仪器和试剂2.1.1脱乙酰度20%,脱乙酰度20%,苯胺蓝壳聚糖(青岛海汇,脱乙酰度75%;上海卡博,脱乙酰度90%),乙酸、乙酸酐、吡啶、无水乙醇、乙酸钠、氢氧化钠、盐酸、甲基橙、苯胺蓝,试剂均为分析纯。2.1.2x-ct-ro磁力加热搅拌机(杭州仪表电机厂),碱式滴定管(成都),乌氏粘度计(上海申谊玻璃制品有限公司),傅立叶型红外光谱仪(美国Nicolet560型),X射线衍射仪(荷兰飞利浦公司)。2.2实验方法2.2.1壳聚糖的制备取10g壳聚糖原料溶于250ml水(含有7ml乙酸)中,待壳聚糖完全溶解。另外量取250ml无水乙醇,将一定量吡啶逐滴加入并搅拌至溶液澄清,再滴加适量乙酸酐混匀。在不断搅拌条件下,将上述混合溶液缓慢加入含壳聚糖水溶液中,将容器密封,搅拌反应1h。待反应完毕后,向溶液中加入2000ml无水乙醇,这时有白色絮状沉淀析出,将溶液离心后弃去上清液。用少量水溶解沉淀并将其离心,若制备水溶性壳聚糖,则弃去不溶物,向溶液中加入1000ml无水乙醇,有白色絮状沉淀析出,将溶液离心后弃去上清液,用乙醇洗涤沉淀3次,在烘箱中80℃下烘干;若制备非水溶性壳聚糖,则将上清液弃去,处理同前。2.2.2氨基含量取0.2~0.3g样品,溶解于30ml标准0.01mol/L盐酸溶液中,加入2~3滴甲基橙-苯胺蓝混合指示剂(V∶V=1∶2),用标准0.01mol/L氢氧化钠溶液滴定。另取1份样品,置于105℃烘干至恒重,测定水分。每个样品各测3次。计算:氨基含量(−NH2)%=(C1V1−C2V2)×0.016G(100−W)×100%(-ΝΗ2)%=(C1V1-C2V2)×0.016G(100-W)×100%脱乙酰度:(D.D.)=(−NH2)9.94%×100%(D.D.)=(-ΝΗ2)9.94%×100%(式中C1为盐酸标准溶液的浓度,mol/L;C2为氢氧化钠标准溶液的浓度,mol/L;V1加入的盐酸标准溶液的休积,ml;V2为滴定耗用的氢氧化钠标准溶液的体积,ml;G为样品重,g;0.016与1ml的1mol/L盐酸溶液相当的氨基量,g)。2.2.3特性粘度[]的测定以0.1mol/LCH3COONa和0.2mol/LCH3COOH为溶剂,在(25±0.05)℃用乌氏粘度计按五点法进行测定。2.2.4傅里叶红外光谱ftir的测定采用美国Nicolet560型傅立叶型红外光谱仪,利用KBr压片法测定。2.2.5x射线衍射xrd的测定采用荷兰飞利浦公司X’PertPro型X射线衍射仪。2.2.6从杂质中萃取取1.2g壳聚糖溶解于2.5%乙酸中,抽滤去除杂质,均匀涂于培养皿上成膜,置于60℃烘箱烘干,接着浸泡在2%NaOH碱液中,30min后用蒸馏水冲洗3遍以上,干燥后小心剥离。3结果与讨论3.1壳聚糖中自由氨基结合酸的量的计算壳聚糖D.D.的测定方法很多,如酸碱滴定法、电位滴定法等。酸碱滴定法原理:由于壳聚糖的自由氨基呈碱性,可与酸定量地发生质子化反应,用碱可反滴定溶液中游离的H+,从用于溶解壳聚糖的酸量与滴定用去的碱量之差,即可推算出壳聚糖自由氨基结合酸的量,从而计算出壳聚糖中自由氨基的含量。电位法与酸碱法原理相同,只是终点是由电位滴定曲线来判断,但电位滴定法存在一定缺点。实验发现,在滴定分子量较大(>40万)的壳聚糖时,由于溶液粘度较大,析出的壳聚糖覆盖在电极膜上,显著影响pH值的测定,使最终结果偏差较大。而酸碱滴定法在滴定过程中使用甲基橙-苯胺蓝混合指示剂,颜色变化从紫红至蓝绿,显色灵敏,操作简便,重复性好。3.2壳聚糖在乙酰化反应后糖基及化合物的含量研究表明,乙酰化反应需在均相条件下进行,在异相条件下制备的产物,不论其D.D.如何,都不能溶于水。壳聚糖溶解粘度随稀乙酸浓度升高而升高,并且在稀乙酸中溶解情况很不稳定,加入足量乙醇有助于体系的稳定。但同时随着乙醇加入溶液粘度也会增高,当乙醇与乙酸体积比为1∶1时粘度达最高值。因此,确定反应体系中乙醇与稀乙酸用量为等体积。此外,少量吡啶的加入能控制沉淀产生,并且能防止乙酰化反应速度过快,但过量吡啶的加入也会产生沉淀。一般而言,壳聚糖与吡啶的质量体积比应控制不大于1:8。另外,关于反应体系溶剂的加入顺序有很多研究,发现先加乙酸酐再加吡啶或乙酸酐与吡啶同时加入均会产生沉淀,而先将吡啶、乙酸酐先溶于乙醇,再将混合溶液与壳聚糖反应则不会产生沉淀。还有,乙酰化反应为一快速反应,时间对反应的影响不大,有研究表明乙酰化反应在1h左右基本结束。决定乙酰化程度的关键因素是反应中乙酸酐的用量。由表1可以看出,随着乙酸酐用量增加,反应后壳聚糖D.D.降低,这点符合壳聚糖在乙酰化反应后糖基上乙酰基增多的理论。①摩尔比=糖残基含量/乙酸酐量;②质量体积比=壳聚糖质量/吡啶体积。同样也可以从图1的红外谱图得到证实,1650~1640cm-1和1560cm-1左右分别是壳聚糖酰胺Ⅰ、Ⅱ谱带,其吸收峰强度与D.D.有直接联系,随着D.D.降低,特征峰吸收强度均增强。由图2还可以看出,随着脱乙酰度降低,壳聚糖分子量增加,这也是由分子内乙酰基基团数目增加引起的。因此,由同种壳聚糖原料,通过控制乙酸酐用量可制得不同脱乙酰度壳聚糖。3.3壳聚糖的x射线衍射由壳聚糖化学结构分析,D.D.较高的壳聚糖分子内氨基和羟基含量较多,易形成较强的氢键,不溶于水;另外,由于氢键的存在,壳聚糖分子具有一定规整性,易形成结晶区,也使基难溶于水。通过乙酰化反应,使酰胺基团增加,打破分子内和分子间的氢键,能改善其水溶性。表2可知,只有D.D.在50%左右的壳聚糖具有水溶性,高于60%的壳聚糖均难溶于水。通过图3对壳聚糖进行X射线衍射分析,可知D.D.为75%的壳聚糖衍射峰尖锐,显示具有很高结晶度,这点也可由图2的红外谱图得到证实:在2922~2880cm-1区间的C—H伸缩振动峰尖锐,显示有高结晶度;而D.D.为54%的壳聚糖衍射峰弥散,10°左右的衍射峰几乎消失,结晶度降低。因为进入分子链的酰基破坏了原有分子链的二次结构,使壳聚糖趋于无定形结构,具有亲水性。3.4壳聚糖的晶体结构为之后研究壳聚糖膜降解行为,应选用分子量较小的上海卡博壳聚糖原料制膜。溶解壳聚糖的乙酸浓度不宜过高,否则流动性能不好,成膜不均匀。此外,干燥温度也需适宜。高温成膜几乎不结晶,力学性能很差,后处理容易破裂;低温成膜结晶度高而晶粒过小,力学性能也不好。还有,D.D.对壳聚糖成膜性能影响较大,由表3可看出,随脱乙酰度增加,壳聚糖膜脆性增加,易破裂。因为壳聚糖结晶度与其D.D.有很大关系。由图4可知,D.D.为90%的壳聚糖衍射峰尖锐,说明结晶度提高;而D.D.为63%的壳聚