量子点在食品检测中的应用

量子点在食品检测中的应用

食品安全是国家面临的一个重要问题。根据近5年中国卫生部办公厅关于全国食物中毒事件情况的通报,全国共有食物中毒事件1285起,中毒人数为46494人,死亡人数802人,其中微生物中毒事件505起,中毒人数28844人,是食品中毒人数最多的一类,占到总数的62%,死亡人数71人。由此可见微生物对食品安全危害之大。这些中毒事件中,主要的致病菌有沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、肉毒杆菌、葡萄球菌等。与其它安全问题相比,由于致病菌可以繁殖,因此可能因为加工过程中某一个灭菌步骤不到位而引发大规模的食品中毒事件。如何快速准确地监控食品在加工、储藏、运输和销售过程中的食源致病菌生长是预防和控制微生物食物中毒的关键。传统的致病菌的检测、鉴定方法仍停留在分离培养鉴定上,其涉及的试验操作烦琐,耗时耗力,而且对难以培养的病原菌的检测,难度较大,检测结果存在不同程度的滞后性。近年来,快速检测方法已有一些报导,包括微生物鉴定纸片法、PCR法和酶联免疫法等。但快速测试纸片法缩短时间的能力有限,PCR法和酶联免疫法虽然大幅度的缩短检测时间至数小时,但所需仪器设备昂贵,需专业人士。因此,找到对微生物进行准确、灵敏、省时、省力和省成本的快速检验方法已经成为当今致病菌检测的迫切需求。量子点作为一种新型的荧光探针,以其优良的荧光性能为食源致病菌的快速检测开启了一扇新的大门。量子点荧光探针激发光谱宽,发射光谱窄,荧光强度大,稳定性好;发射光谱可以通过量子点的尺寸来控制,可以同时进行多重标记,在单一的激发波长下实现多重检测。采用量子点荧光检测技术能够大幅缩短检测时间,检测极限低,节省人力物力。1检测量的选择原则量子点是一种由Ⅱ~Ⅵ族元素或Ⅲ~V族元素组成,直径在1~10nm的半导体荧光纳米粒子。在量子点中,由于电子和空穴被量子限域,连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构,所以量子点受激后可以发射荧光。量子点显示出了优良的荧光特性:(1)量子点的荧光发射波长与其尺寸密切相关,可以通过改变其组成和尺寸来获得任意可见光范围内的发射波长;(2)量子点荧光强度和稳定性好,分别是传统荧光染料的1000倍和100倍,几乎不受环境的影响,且可以反复激发,有利于长时间的试验观察;(3)量子点的发射光谱窄而激发光谱宽,并且有较大的斯托克斯位移,所以可以利用同一激发光来激发不同发射波长的量子点,实现对不同待测物的同时检测,并可以避免发射光谱和激发光谱的重叠。量子点的合成主要有有机相合成和水相合成两种方法。由于有机合成法合成的量子点亲水性差,表面缺乏与生物分子发生反应的化学基团,限制了它的应用。致病菌检测所用的量子点探针一般都是采用水相合成然后进行修饰所得。现阶段多在使用巯基做稳定剂的情况下采用水相合成法制备量子点。水相合成法制备量子点的操作简单,量子点稳定性好,水溶性强,并且能通过选择带不同官能团的巯基试剂控制量子点的表面电荷和表面性质,使得量子点能适应各种应用。基于量子点的优良荧光性能制成的荧光探针在食源致病菌检测上将有很好的应用前景。2改造菌体标记方式量子点荧光探针对致病菌的检测方式有多种。在细胞水平,量子点荧光探针可以标记菌体,标记致病菌菌体的标记方式又有化学结合法和免疫结合法。在分子水平上,量子点荧光探针可以检测致病菌的DNA及代谢出来的毒素。2.1利用小体酶基因修饰的表面基量子点可以通过化学结合与目标菌结合,致病菌细胞膜表面的蛋白质的氨基能够在交联剂的作用下同氨基化的量子点相结合,通过量子点与目标菌结合后的荧光增效效应,就可以检测样品中目标菌的浓度。样品中目标菌的浓度越高,与其结合的量子点就越多,荧光强度也就越强。傅昕等利用量子点荧光探针与细菌的化学结合,建立了一种快速细菌计数的方法。他们使用三辛基膦-三辛基氧化膦法(TOP-TOPO)合成了CdSe/ZnS核壳型量子点,再用巯基丙酸修饰,使得量子点表面获得大量的羧基基团。然后用l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为量子点与细菌的交联剂,EDC可以与量子点表面的羧基发生反应,形成活性中间体,NHS做稳定剂稳定中间体。经修饰的量子点能够与细菌表面蛋白上的氨基结合,从而实现对细菌的检测。在以金黄色葡萄球菌为目标菌时,检测极限达到了1.0×102CFU/mL。但是化学结合法没有特异性,不能只针对某一种细菌进行检测,只能检测出样品中细菌的总数,并且由于食品样品的复杂性,很容易发生错误的结合造成试验误差。2.2间接法与间点法的比较荧光免疫法是常用的生物标记法。抗原和与之对应的抗体之间通过特殊的分子三维结构结合,具有高度的特异性。量子点在连接某种致病菌的抗体后,就形成了这种致病菌的特异性荧光探针,它就能够与这种致病菌之间发生特定的免疫结合,形成荧光免疫复合物,通过荧光增强效应就能测定出目标菌的浓度。由于免疫反应的特异性,量子点荧光免疫分析是量子点标记最活跃的领域。此外,由于量子点的发射波长可调性,研究中可以利用不同致病菌的抗体标记不同发射波长的量子点,在同一激发波长下实现不同致病菌的定性和定量检测。量子点连接抗体的方式有两种:(1)直接将抗体连接到量子点上,称为直接法;(2)通过链霉素生物素亲和作用将抗体连接到量子点上,称为间接法。相比于直接法,间接法的操作略微复杂,但是其灵敏度和检测极限都要好于直接法。MeganA.Hahn等利用链霉亲和生物素相互作用,来连接量子点和大肠杆菌进行检测。先将生物素修饰的大肠杆菌抗体与大肠杆菌混合孵育,使大肠杆菌抗体与大肠杆菌充分连接,再分别将链霉素修饰的CdSe/ZnS型量子点和链霉素修饰的无机染料异硫氰酸荧光素(FITC)混合其中孵育,由此将量子点和FITC标记在大肠杆菌上,再对样品进行荧光光谱分析和荧光显微镜分析。结果表明,量子点荧光探针的灵敏度比FITC荧光探针的要高出两个数量级,这是由于在同一链霉素上可以连接的5~10个量子点只能连接3~4个FITC,更多数量的量子点荧光探针及其更好的荧光强度能提高检测的灵敏度。并且在连续测量中,量子点探针的荧光持续时间可以达数小时。刘晓红等也利用类似的量子点荧光免疫标记法检测炭疽芽胞杆菌。通过抗原抗体反应,结合生物素与亲和素的特异性作用,对炭疽杆菌实现量子点的标记。利用其实验室自制的荧光检测系统对样品进行定量检测,结果表明,在1×102~1×106CFU/mL时,相对荧光强度与炭疽芽孢杆菌的浓度呈良好线性关系。现在还发展出了新型的免疫磁珠富集-免疫量子点标记技术。YuZhao等利用该技术同时测定了鼠伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌和大肠杆菌。3种致病菌的抗体分别连接到发射波长为620,560,520nm的量子点上形成针对不同致病菌的荧光探针。另外,3种致病菌的抗体也被结合到纳米磁珠上,形成能特定吸附致病菌的免疫磁珠。纳米磁珠的主要目的是对目标菌进行分离富集。在富集过程中免疫磁珠、目标致病菌、免疫量子点形成(磁珠-细菌-量子点)“三明治”式复合物。通过荧光光谱分析或者荧光显微镜可以得到量子点的荧光测试体系中致病菌的污染情况。试验还发现含有高浓度蛋白质的样品在测定时,蛋白质会干扰对致病菌的测定,需要在试验之前将蛋白质去除或者稀释。其原因可能是过多的蛋白质会导致抗体吸附的特异性下降,使得检测准确度和灵敏度降低。此法的优点在于将磁分离富集技术和量子点荧光探针技术整合起来,能极大的降低对致病菌的检测极限,并且,在准好免疫磁珠和量子点的情况下,检测致病菌的时间在2h以内,检测时间大幅度缩短。2.3荧光原位杂交法荧光原位杂交技术是细胞生物学和分子生物学技术相结合的产物,它主要是选择已知序列的DNA片段,用荧光材料标记后作为探针与目标菌的DNA片段按碱基互补的原则进行杂交,形成可以被检测的双链DNA结构。由于DNA的特异性,荧光原位杂交法具有很高的选择性。荧光原位杂交法主要步骤包括玻片的制备、细胞固定、杂交、探针的洗脱和镜检,操作简便,检测周期短。基于量子点的优良荧光性能,可以设计出新型的DNA荧光探针,建立效果更好的荧光原位杂交法。研究中一般使用亲和素修饰量子点,生物素连接DNA探针,利用亲和素和生物素之间的相互作用结合形成新型的DNA荧光探针,通过对目标菌的特定DNA序列的定性定量分析来确定目标菌的种类和数量。彭奕冰等利用A型肠毒素(SEA)基因和FemB基因合成了两种量子点-亲和素-生物素-DNA探针,并用来检测金黄色葡萄球菌,对比PCR法,荧光原位杂交法具有快速、简便、特异性强的特点。在同一激光激发下,不同大小的纳米颗粒可以发出不同颜色的光。因此,将多种异色量子点标记相应的病原体核酸探针与待测基因反应,根据所结合的探针发出荧光的颜色来判断待测基因为何种病原体基因,可在一次检测中同时检出多种病原体。缪婷婷等在同一激发光(420nm)下检测提取的沙门氏菌、李斯特菌和金黄色葡萄球菌DNA混合溶液的荧光强度,得到三者混合的荧光光谱。通过菌落个数和荧光强度的线性方程来定量计算出相应菌落的个数,从而实现对3种食源性致病菌同时定量检测。2.4基于量子点标记二抗的间接竞争荧光探针检测食源致病菌往往能通过代谢产生对人体有害的毒素,诸如葡萄球菌肠毒素、霍乱弧菌肠毒素、大肠杆菌肠毒素、黄曲霉毒素等。试验中可以通过其代谢产生毒素的多少来判断致病菌对食品的污染程度。量子点荧光探针检测致病菌毒素的方法主要是利用免疫反应,利用致病菌毒素的抗体修饰量子点,形成特异性强的量子点荧光探针。李园园等建立了基于量子点标记二抗的间接竞争荧光免疫吸附法,并用此法检测了花生种黄曲霉毒素。以谷胱甘肽为稳定剂,在水相中直接合成碲化镉(CdTe)量子点,并利用EDC作交联剂与兔抗鼠二抗进行共价偶联,采用黄曲霉毒素B的单克隆抗体建立荧光免疫分析法(cFLISA)方法。结果表明,该方法的灵敏度和最低检测限值分别为0.023,0.001ng/mL,与传统的有机染料FITC-二抗法比较,灵敏度提高了30倍。此法也为其他真菌毒素的检测提供了参考。Goldman等用夹心免疫法同时检测霍乱毒素、蓖麻毒素、志贺样毒素1、葡萄球菌肠毒素B等4种毒素的混合物,结果显示,对毒素的定量分析和定性分析能同时进行。3p-q-ms检测在食源性致病菌检测中,基于量子点的荧光探针检测法灵敏度高,检测迅速,能快速有效地检测到食品中含量极少的致病微生物。但是量子点检测的研究仍有许多需要改进的地方:(1)需要寻找合适的表面配体与量子点牢固结合,使得量子点能够化学和光学稳定,同时又能保证同目标的结合。(2)量子点荧光探针具有潜在毒性,常用量子点探针一般含有镉、砷等潜在有害元素,若要在安全范围内使用,则需要国家或者行业出台量子点荧光探针的相关使用标准和规范。(3)由于食品,特别是深加工的食品在组成上十分复杂,这可能导致量子点荧光探针的非特异性连接造成探针的错误的响应。这也是量子点荧光点探针在食品检测中的最大挑战。选择出高选择性和高特异性的生物分子并将其链接在量子点上,用来对致病菌进行分析鉴定