免疫检验 第十三章 免疫细胞分离与检测

第十三章免疫细胞分离与免疫细胞功能检测及应用【掌握】外周血单个核细胞、淋巴细胞、T细胞亚群分离的原理；T、B细胞、NK细胞主要的表面标志。各种淋巴细胞功能检测的原理.细胞分离基本原理不同细胞密度不同人的红细胞密度为1.093

粒细胞密度为1.092单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090

不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞。

Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。

密度梯度离心(Ficoll)离心二、淋巴细胞分离（去单核细胞）贴壁粘附法

（单核细胞贴壁生长的特点、将悬液置玻璃或塑料器皿，未贴壁的为淋巴细胞，此法易造成B流失）吸附柱过滤法

（单核细胞贴壁生长的特点，将细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶的层析柱中，洗脱下来的为淋巴细胞）

Percoll

分离液法

（连续密度梯度离心，不同密度的细胞悬浮于各自不同的密度区带）Percoll法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图E花环沉降法（T细胞与绵羊红细胞形成E花环后用淋巴细胞分层液分离，E花环沉在管底）尼龙毛柱分离法（B细胞和单核细胞易粘附于尼龙纤维表面，将用HANKS液浸泡后的单个核细胞悬液加入充填有尼龙毛的聚乙烯塑料管内，洗脱液中为T细胞，然后边冲边挤压塑料管，洗下B细胞。

三、T、B细胞和T细胞亚群的分离大小免疫磁珠分离细胞的特点比较

比较项目大磁珠小磁珠对细胞的影响对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养。对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养。对流式细胞仪的影响阻塞流式细胞仪的喷嘴，影响散射光。可直接上流式细胞仪检测，不影响散射光。分离条件要求技术简单，分离可在试管中完成。需要很强的磁场来分离细胞。收率得率高。得率不高。纯度纯度低。纯度高。分离时间分离速度快。分离速度慢。分离成本成本低。需要很强的磁场来分离细胞，需要一次性的分离柱，不能在普通试管进行。第二节淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类

常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗（CD）。

一、T细胞表面标志及其亚群

CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（regulatoryTcell,TrorTreg）辅助性T细胞Th1（IL-2、IFN-γ、TNF-β

CD3+CD4+CD30-)Th2（IL-4、IL-5、IL-6或IL-10

CD3+CD4+CD30+）细胞毒性T细胞Tc1（CD3+CD8+CD30-)Tc2（CD3+CD8+CD30+）调节性T细胞CD4+CD25+调节性T细胞CD8+调节性T细胞二、B细胞表面标志

SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体、小鼠红细胞受体都是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。

成熟B细胞的mIg主要为mIgM、mIgD。CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。

人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD16+CD56+淋巴细胞认定为NK细胞。三、NK细胞表面标志

第三节抗原提呈细胞表面标志的检测抗原提呈类细胞表面标志第四节淋巴细胞功能检测淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。

体内实验主要是进行迟发型超敏反应，间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应.

体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定.淋巴细胞分类T细胞（负责细胞免疫功能）B细胞（执行体液免疫功能）NK和K细胞（非特异性免疫作用）1.原理：淋巴细胞DNA合成分化母细胞刺激物细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松（一）T淋巴细胞增殖试验

未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞过渡型细胞大小(直径μm)12～2012～166～8核大小、染色质增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4个有或无无有丝分裂有或无无无胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色浆内空泡有或无有或无无伪足有或无有或无无2.淋巴细胞转化的刺激物非特异性刺激物：PHA------T细胞ConA-------T细胞PWM-------T、B细胞LPS-------B细胞特异性刺激物：异种抗原同种组织抗原

同位素法：PHA淋巴细胞（54h）

DNA合成期+3H-TdR掺入

收集细胞

检测β射线

测定细胞内的3H-TdR3.检测方法形态法：刺激物淋巴细胞（4-6天）母细胞化（1）形态学检查法方法学评价：优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。（2）3H-TdR掺入法优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。（3）MTT比色法(二)T细胞分泌功能测定

体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功能。

1.原理：靶细胞抗原T细胞观察杀伤活力致敏CTL靶细胞（三）T细胞介导的细胞毒试验形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞计数残留肿瘤细胞同位素法：淋巴细胞（CTL）+含51Cr的肿瘤细胞肿瘤细胞破坏51Cr

释放测定γ射线2.方法意义：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力

(四)体内试验特异性抗原皮肤试验PHA皮肤试验二、B细胞功能检测溶血空斑试验B细胞抗体形成功能的检测体内试验2.方法学：经典溶血空斑形成试验被动溶血空斑试验

(一)溶血空斑试验溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。

应用与方法学评价