人中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂研究报告

---....word.zl人中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂争论人中性粒细胞弹性蛋白酶(humanneutrophil人中性粒细胞弹性蛋白酶(humanneutrophilelastase，HNE重构〔如肺炎〕、成人呼吸窘迫综合征、肺纤维化、急〔慢〕性肺损伤、肺水肿、动脉粥样化。目前，国外用HNE抑制剂来治疗这一类炎症疾病的争论格外广泛，并已成功开发出第一个以抑制HNEsivelestatsodiumhydrate〕，从而促进了HNE抑制剂的争论与开发。BM的生理、病理作用及构造特征HNE，又称人白细胞弹性蛋白酶〔humanleukocyteelastase，IRE〕，属于基质金属蛋白酶类〔matrixmetalloproteinases,MMPs〕，即MMP-12,是一种金属离子依靠性基质降解酶，需要微量Zn2+和Ca2+离子的存在才具有酶活性，其底物类型格外广泛，几乎可降解细胞外基质约每106个细胞中含有HNE的总量为3μgHNEHNE过量表达那么会对机体组织、基质造成危害，表现为破坏血管壁组分出血管并向炎症部位趋化集中及释放IL-8、TNF-α等炎症因子；它还能降解细胞基质，催化caspase3诱导的细胞凋亡。据报道，HNE还能增加病毒、细菌及癌细胞对正常细胞的黏附力气，促进微生物的入侵及癌细胞的增殖和转移。HNE存在于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中，是由218个氨基酸组成的单一肽链，分子质量大约25.9kD，含4个二硫键，是丝氨酸蛋白酶家族一员，因此与其他丝氨酸家族蛋白酶具有30%～40％的同源性，最适pH值接近中性。HNE的基因位于19号染色体的短臂末端，是50kb的DNA片段，成熟的中性粒细胞中并无HNE的mRNA表达，说明此种酶只在未成熟的骨髓细胞中合成。酶的催化中心由His41、Asp88和Ser173三个氨基酸残基构成，Ser残基侧链上羟基具有很高的亲核性，简洁结合不带电的小分子氨基酸，如Val、Ala、Leu、MetBM抑制剂HNE对机体会产生各种病理作用，故关于其抑制剂的争论也受到广泛关注，其中包括源性抑制剂、合成的外源性抑制剂〔蛋白类、拟肽和杂环化合物〕以及自然提取物等。源性抑制剂人体存在很多种针对HNEHNE抑制剂Elafin7kD，是酸稳定性多肤；α-抗蛋白酶〔α-antiprotease〕在血浆中具高浓度，并由此进入组织发挥作1 1用。上述源性抑制剂包括α-巨球蛋白均为分泌性弹性蛋白酶抑制剂，其中α-抗蛋白酶被2 1认为是在体各种脏器中起主导作用的源性HNE抑制剂。α-抗蛋白酶 它在很多生理、病理过程中〔如血液分散、纤维蛋白溶解、炎症等〕1起调整蛋白分解的作用，并且对防止蛋白水解性组织损伤起重要作用。据报道先天性α-抗1蛋白酶缺损极易引发肺气肿和自发性肺纤维化〔idiopathicpulmonaryfibrosis〕。α-抗蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员，存在于血浆中，平均分子质量约50k1D，含有3个β片层构造和假设干αMet358打算了它对HNE的抑制特异性，HNE与之结合后形成稳定酯构造，致使酶的活性中心构象发生转变，不能去酞基化，这种抑制机制被称为性底物抑制。对α-抗蛋白酶的构造争论显示，它和其他HNE拮抗剂一1样，在酶结合位点或四周的Met上的硫醚键对化学氧化格外敏感，一旦Met被亚砜化后，α1-抗蛋白酶即失活。在体氧化自由基的增多是造成这种源性抑制剂失活的主要缘由氧化物酶通过过氧化酶-过氧化氢-卤化物系统使α_抗蛋白酶氧化失活，从而到达HNE活1性增高，促进细胞渗透转移的目的。在体外试验中，中性粒细胞中的过氧化物系统可使α-1抗蛋白酶在10秒之失活50%，20秒之完全失活。Elafin 它是一种被争论得比较深入的源性抑制剂，又称为弹力素，属于Trappin-2基因家族。它在多种上皮组织中表达，如毛囊、食管、阴道和口腔中等。在人皮肤正常组织中没有表达，但在皮肤受外伤和牛皮癣等炎症反响时那么会猛烈地表达。翻译后的elafin蛋白质前体是由117个氨基酸组成的多肤链〔12.3kD〕，包括由22个氨基酸组成的信号肤，其活性部位在C端，以49.9kD的成熟蛋白，即elafin。争论说明，在HNE诱导的急性肺损伤仓鼠模型中，于诱导前1小时经气管赐予elafin，其抑制HNE的IC 为8.1μg/kg。50目前对elafin的争论着眼于其在动脉粥样硬化、心脏移植后冠状动脉疾病、心肌坏死以及的主要并发症，发病原理与冠状动脉血管壁增厚有关，而由HNE活性上升引起的弹性蛋白降解沉积、IL-1程中起关键作用。在家兔心脏移植模型中，赐予重组人elafin可以有效的降低HNE活性，形态学、免疫组化和生化分析说明，与比照组相比，elafin给药组家兔的血管壁增厚程度降低70%。将elafin细胞外弹性蛋白量；虽然elafin会导致血管膜形成减缓，总体上仍具有防止血管粥样硬化恶化的效果。外源性抑制剂对合成类HNE抑制剂的争论已有约20年历史，其间涌现出大批很有前景的小分子合成systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS〕的HNE特异性抑制剂上市。合成类HNE抑制剂又包括蛋白类、三肽或四肽和氮杂环类化合物等，此外，有报道称β酰胺类抗生素和苯基丁氮酮类上市老药对HNE也有抑制作用。制剂的争论中，承受构建的限制性构造组合肤库，筛选HNE的特异底物，这种方法筛选得HNE抑制剂在序列上具有很高的同源性，并且对其重组蛋白的分析说明它们均具有HNE抑制作用，抑制常数Ki65nmol/L。在对自然HNE抑制剂的争论过程中觉察，每种抑制剂与HNE活性中心结合的作用位点〔P〕几乎都在一个延长出来的环上，而P1位点上的氨基酸残基主要打算抑制剂的抑制特1异性。HNE简洁与P 位点上有小烷基侧链的底物结合，尤其易与Val残基结合。构建的多1肽依据自然底物的构造形式，形成环状构造，可将P1位点递呈到酶的活性中心。在此构造根底上，对P1和其他位点的氨基酸残基进展修饰，使之进一步成为对HNE具有高度选择性的化合物。据报道，限制性构造组合肽库同样可以用来筛选α-胰糜蛋白酶、猪胰弹性蛋白选出的大局部抑制剂可以同时抑制这一类酶。西维来司钠2023年11月，氮杂环类化合物西维来司钠〔商品名Elaspol〕在日本上市，其化学名为N-[2-[4-(2，2-二甲基丙酸基〕苯磺酰氨基丁氨基乙酸钠，分子质量为528.51D，适应证是全身性炎症反响综合征和急性肺损伤，且正在进展用于呼吸窘迫综合征治疗的n吸器引起的压力性损伤及呼吸道感染的并发率典型性肺炎临床表现亲热相关的病症，我国已于2023年5月批准对其进展临床试验，它是我国发生非典型性肺炎后首个通过“绿色通道〞加快批准进入临床试验的药物。以琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-N-对硝基苯胺为底物的酶抑制试验说明，西维来司钠对HNE的IC 为(0.044±0.003)μmol/L,抑制常数K为(0.20±0.02)μmol/LHIVE的竞争50 i性抑制剂，并且具有很高的专一性，即使在浓度为100μmol/L时，它对胰蛋白酶、凝血酶、纤溶酶、激肽释放酶、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶G等仍没有抑制作用，对猪胰弹性蛋白酶仅有很微弱的抑制作用，其IC 是对HNE的IC 的130倍。而它对各种试验动物，如小50 50鼠、仓鼠、大鼠、狗及家兔的中性粒细胞弹性蛋白酶都有抑制作用，且酶学反响测得的其IC 甚至比对HIVE的IC 更小。50 50及体外模型中均表现出良好的药理作用。给伯莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型静脉注射本品，可以削减成纤维细胞的生成，降低中性粒细胞在炎症部位的聚拢数量以及炎症因子如IL-1β、血小板源生长因子〔PDGF〕、巨嗜细胞炎症蛋白-2、胰岛素样生长因子A等的mRNA并主要作用于发病急性期。腺炎等，其应用前景宽阔。HNE的体外表达争论体外筛选HNE抑制剂使用的酶绝大局部是从人白细胞中提取获得，由于提取本钱昂贵，得率不高，且血液制品缺乏平安性，迫切需要查找替代的酶生产方法。为了更快速、有效、大量的筛选HNE抑制剂，有人进展了HNE全酶表达由于HNE对大肠杆菌细胞壁组分具有降解作用以及在T7启动子表达系统中难以获得有活性的HNE，酶完整cDNA克隆表达争论承受了M13噬菌体系统。HNE的cDNA位于人白细胞株cDNA文库中，由编码8个氨基酸残基的IL-2前导肽DNA以及238个氨基酸残基的HNE前体DNA组成，以可溶性蛋白的形式表达，并可以通过赖氨酞肽酶切割获得有活性的HNE。表达纯化后所得HNE经一系列酶活性检测和与抑制剂反响的检测，说明其性质与自然HNE15μgHNE〔3～4天〕，与自然HNE提取方法相比并没有多大优势〔每毫升全血中可得2.36μgHNE〕。1重组HNE和自然HNE与抑制剂的结合活性比较〔Tab1.TheparationofbiningactivitiesofrebinantHNEandnativeHNEwithinhibitors〕——————————————————————抑制率(%)(0.1g/L)———————————————重组HNE 自然HNE——————————————————————胰蛋白酶抑制剂 93 73α1-抗蛋白酶 78 47糜蛋白酶抑制剂 0 0——————————————————————酶催化构造域表达MMPs外，承受催化构造域单独作用，还具有比全酶更高的稳定性，可能是由于缺失了C端自我降解构造的缘由。HNE催化构造域〔Phe100-Gly263〕片段DNA是缺失前导构造和血液结合素样构造的平头末端蛋白DNA序列，以pGEMEX质粒为载体，在大肠杆菌中表达，经过复性、提取纯化后获得的每升菌液可产生蛋白量约为23mg比自然蛋白酶提取法及全酶表达法的产率大大提高。蛋白几乎全部存在于包含体中，经上柱纯化，并在Ca2+、Zn2+存在下