纳米氧化铜对小鼠急性毒性及蓄电性研究

纳米氧化铜对小鼠急性毒性及蓄电性研究

动物铜中毒国内外均有报道。反刍动物铜中毒通常常见。随着高铜饲料在猪和鸡的生产中得到广泛应用，猪和鸡的饲料中毒的案例很少。实验研究证实,铜的中毒剂量因动物种类、日粮类型和铜化合物的不同而异。绵羊和猪硫酸铜的中毒剂量分别为25和300mg/kg饲料;牛、猪和禽硫酸铜的最大耐受量分别是100、250和300mg/kg饲料。不同形式的化合物对动物的毒性也不同,依次为CuCO3>Cu(NO3)2>CuSO4>CuCl2>Cu2O(粉)>CuO(针)>Cu(铜丝)。本研究室前期研究发现,在饲料中添加纳米氧化铜可显著提高锌、锰的表观消化率,显著提高肉鸡生产性能及抗氧化能力,并且在饲料中以纳米氧化铜形式添加铜8mg/kg和16mg/kg能够提高肉鸡免疫功能,但纳米氧化铜的急性毒性和蓄积毒性尚未见报道。本试验旨在研究纳米氧化铜对小白鼠的急性毒性和蓄积毒性,确定其LD50和了解纳米氧化铜对动物的蓄积毒性的强弱、蓄积中毒的临床症状和蓄积中毒死亡小鼠的病理剖检变化,为畜牧生产和兽医实践合理应用纳米氧化铜提供理论依据。1材料和方法1.1材料2.2gg健康的昆明小白鼠雌雄各半(体重18~22g)。全部动物引入喂养1周后,投入试验。要求饲养室的室温为(23±1)℃,相对湿度为(55±5)%,12h光照。1.2试验材料纳米氧化铜,采用固相反应合成方法制备,球形,粒径在100nm,大小均匀,无团聚现象,纯度100%,由山东科技大学提供。1.3测试方法1.3.1急性中毒试验提前试验选取健康小白鼠20只,雌雄各半,随机分为5个组,每组4只,确定0致死量和100%致死量。1.3.2灌胃给药剂量ld50根据反复预试验结果,确定100%的死亡剂量和0的死亡剂量,0致死量和100%致死量之间设5个试验组,分别为270.09、366.12、496.27、674.28和916.15mg/(kg·bw),另设1个空白对照组。选取小白鼠60只,雌雄各半,按体重随机分为6组,每组10只,禁食12h后,各组按0.2ml/10gbw一次性灌胃给药。观察14d内小白鼠的生活状态及死亡情况,对死亡小鼠进行实时解剖,观察其内脏器官的变化及其它异常情况。1.3.3给药剂量的确定蓄积毒性试验(20d蓄积试验法):取20~22g小白鼠,共设5组,每组10只,雌雄各半,第一组为空白对照组,试验组分别以纳米氧化铜的形式添加铜28.90(1/20LD50)、57.81(1/10LD50)、115.62(1/5LD50)和298.05(1/2LD50)mg/(kg·bw)剂量,每日灌胃1次,连续灌胃20d,各组给药总剂量分别为0、1、2、4、10个LD50的剂量。在给药期间观察小白鼠的死亡及有无异常反应;给药停止后连续7d观察小白鼠的一般情况及死亡情况。1.3.4两组间死亡数法试验结束时,根据下列标准进行评价:观察停药后7d内的死亡情况。若各剂量组均无死亡,即为蓄积性不明显;若仅1/2LD50剂量组有死亡,其它组均无死亡,则为弱蓄积性;若1/20LD50剂量组无死亡,其它组间死亡数有剂量反应关系时,则为中等蓄积性;若1/20LD50剂量组有死亡,且有剂量反应关系时,则为强蓄积性。1.4基本日粮基础日粮组成与营养成分见表1。2结果2.1和976.结果显示:纳米氧化铜0和100%致死量分别为270.09和916.15mg/kg。纳米氧化铜对小白鼠LD50为578.09mg/(kg·bw),95%可信限343.92~971.63mg/(kg·bw),见表2。2.2般资料及病理变化临床表现:各剂量组小鼠在灌胃以后的初期都表现出精神沉郁,呆立不动,眼睛半睁,全身震颤,四肢无力,不爱活动,扎堆,畏寒,呼吸急促,采食和饮水明显下降;高剂量组的小鼠在灌胃3h后开始死亡,大部分小鼠一般在24~48h内死亡,空白对照组和试验1组的小鼠很快恢复正常。病理变化:胃膨大、鼓气并充满黑色的内容物;盲肠内充满黑绿色的内容物;肝脏变性颜色变为土黄色,胆囊内充满黑色的液体;肾脏为黑色;膀胱内充满黑色的尿液;在短时间内死亡的小鼠以上病理变化不明显。2.3小鼠灌胃后死亡情况各剂量组连续20d灌胃后,继续观察7d,结果0和1/20LD50剂量组小白鼠全部存活,毛顺而有光泽,生长正常,停药后7d内无死亡,剖解观察无异常变化。1/10LD50剂量组小白鼠在灌胃后第10d死亡1只雌鼠,第19d死亡1只雄鼠;1/5LD50剂量组小白鼠在灌胃后第7d开始死亡,第15d停止死亡,结果存活5只,死亡5只,存活雌鼠3只,雄鼠2只;1/2LD50剂量组小白鼠在灌胃后第2d开始死亡,第12d停止死亡,结果小白鼠全部死亡。依据判定标准,证明纳米氧化铜对小白鼠有中等蓄积毒性作用。2.4剖解内容物中毒小鼠的临床表现为精神沉郁、食欲废绝;肌肉松弛,排黑色稀粪;消瘦,贫血,肌肉震颤。死亡的小白鼠剖解后均可见胃膨大、鼓气并充满黑色的内容物;盲肠内充满黑绿色的内容物;肝脏肿大变性呈土黄色,胆囊肿大并积有黑色的胆汁;肾脏为黑色;膀胱内充满黑色的尿液;在短时间内死亡的小鼠以上病理变化不明显。3讨论3.1急性毒性试验家兔、大鼠、人和小鼠硫酸铜的LD50分别为159mg/(kg·bw)、300mg/(kg·bw)、10g/(kg·bw)、7mg/(kg·bw)(腹腔注射)。急性中毒呈现严重的胃肠炎,表现呕吐、流涎、腹痛、腹泻、粪便稀并混有粘液,呈深绿色(有铜绿素化合物存在)。此外,还有心动过速、脉搏微弱、惊厥、麻痹,一般在24~48h内虚脱而死。发病动物存活时间长者,会出现溶血,黄疸和血红蛋白尿。病理变化急性病例以胃肠型即胃粘膜充血、水肿、溃疡,肝、脾、肾脂肪变性和坏死为主要特征。本试验通过对纳米氧化铜急性毒性试验的研究结果表明,纳米氧化铜对小白鼠LD50为578.09mg/(kg·bw),95%可信限343.92~971.63mg/(kg·bw)。其纳米氧化铜的毒性属于低毒物质,但对肝脏、肠道和肾脏等脏器有一定毒性,对胃有一定的刺激,使食欲减退,各组小白鼠灌胃后短期内精神萎靡,食欲不振,对照组和低剂量组动物在短期内就恢复食欲。灌服高剂量纳米氧化铜组的小鼠在死亡前出现精神不振、采食和饮水明显下降、四肢无力、不爱活动等现象。其半数致死量表明毒性不大,对照组体重也有下降,表明此指标不是因为添加纳米氧化铜所致。从小白鼠的发病时间、病程经过、死亡情况观察结果的综合分析,916.15、674.28、49.27和366.12mg/(kg·bw)剂量组引起了小白鼠典型的铜中毒症,显示出明显的量效性。易后生研究结果表明,用玉米一豆饼型饲料(含铜1600mg/kg)饲喂30日龄的AA肉鸡,引起中毒发病全部死亡。本试验中灌胃剂量铜含量366.12mg/(kg·bw),对小白鼠的毒性较大,灌胃剂量铜含量为270.09mg/(kg·bw)未引起小鼠的死亡,应证纳米氧化铜对小白鼠的毒性剂量范围。3.2对机体的危害羊、牛、猪和小鸡硫酸铜的中毒剂量分别为20、200、250和325mg/kg,中毒动物表现为黄疸,肝微肿、易碎,肾肿大、常有出血点,脾肿大、呈棕色或黑色。牛羊的肝脏呈鲜黄或土黄色,实质硬而脆,切面结构模糊;肾呈古铜色,柔软易碎;脾切面膨隆,边缘外翻;皱胃、肠道严重充血、出血。猪肝脏显著肿大,重量为正常肝的2倍以上,肝实质硬突,胆囊扩张,个别肝严重肿大并且呈橙黄色;肾充血、淤血;脾肿大、紫黑色;胃底粘膜严重出血,肠粘膜出血,严重者呈黑红色糜烂状,肠粘膜淋巴结出血。本试验结果显示,纳米氧化铜对小白鼠有中等蓄积毒性作用,长时间使用高剂量纳米氧化铜饲料添加剂可对动物机体各种组织产生一定的损害作用,加之纳米氧化铜的生物利用率非常高,所以在给动物和人类以纳米氧化铜进行补铜时剂量不宜过高时间不宜过长,盲目滥用只会适得其反。病理形态学观察结果表明,小白鼠铜中毒病变靶器官是肝脏,铜在体内组织的分布、蓄积和代谢密切相关。由于铜盐的刺激和腐蚀作用,雏鸡采食铜中毒日粮,铜盐进入消化道引起剧烈反应和造成病理损伤,表现为肌胃角质层增厚、龟裂乃至呈绒毛状,肠粘膜上皮变性坏死,肠绒毛断裂,这是铜盐直接作用于胃肠道粘膜的结果,导致胃肠道功能受损。本试验中毒小鼠的肝脏病变明显,肝脏静脉扩张明显,红细胞充斥其中;肝小叶呈放射状,轮廓模糊;大范围肝细胞颗粒变性、空泡变性、气球样变性;部分肝细胞细胞核浓缩、崩解;细胞坏死明显;肝窦结构紊乱,充斥大量红细胞或组织细胞坏死后的碎屑,与文献报道一致。铜在肝脏中蓄积,当蓄积量一旦超过肝脏的承受能力,肝细胞变性