中草药抗大肠杆菌性腹泻作用机制的初步研究

中草药抗大肠杆菌性腹泻作用机制的初步研究

仔猪的肠腹泻是一种常见的仔猪育种疾病。发病率和死亡率很高，已成为养猪业的障碍。临床上常用来治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的抗菌药物主要依赖于它们的抑菌作用,而中草药的治疗作用则是多方面的,其作用机理很复杂。引起仔猪大肠杆菌性腹泻的病原为肠毒素性大肠杆菌(ETEC),其主要通过菌毛黏附素牢牢地黏附在仔猪黏膜表面,并产生肠毒素,继而破坏体内水分和电解质正常的吸收和排泄动态平衡,使肠管中的液体蓄积而导致腹泻。另外,由于年龄、免疫状态、生理机能、饲养条件等多种诱因造成的消化机能紊乱也是重要不利因素。仔猪消化道内食物分解不全的产物或由于发酵产生的低级脂肪酸,刺激肠蠕动加快而引起泻下。病猪消化机能紊乱使肠道菌群失调,大量有害细菌产生的有毒产物刺激肠黏膜发生炎症过程,促进液体从肠壁向肠腔渗出,加重了泻下。本研究针对以上发病机理,通过大青叶、板蓝根、连翘、败酱草4味中草药及其复方配伍对大肠杆菌的体外抑菌活性、抗肠毒素LT作用、减少炎性产物刺激下的肠液渗出、抑制肠蠕动加快及对抗药物性腹泻等5个试验初步探讨中草药治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的作用机理。1材料和方法1.1材料表面1.1.1药物的提取液板蓝根(Isatisindigotica)、大青叶(Isatistinctoria)、连翘(Forsythiasuspensa)、败酱草(Patriniavillosa),均由黑龙江省药材总公司提供;大青叶、板蓝根采用水提醇沉淀法制备提取液,连翘和败酱草采用双提法(水提醇沉淀法及蒸馏法)制备提取液。4种药物的提取液均为1mL相当于原生药1g。方剂:为10余种中草药经过前期正交试验选出的优化复方,由连翘、败酱草、板蓝根按一定比例配伍组成。上述药液均经流通蒸汽灭菌30min,4℃冰箱保存备用。1.1.2病毒猪大肠杆菌O149K88,由东北农业大学微生物教研室提供。1.1.3培养基的制备普通营养肉汤、营养琼脂培养基、蛋白胨水培养基按常规方法制备;CAYE(caseinicacid-yeastextract)培养液参照诸长贵等的方法制备。1.1.4术后观察和护理日本大耳白兔,体重(2.2±0.2)kg,雌雄各半,手术前禁食48h,自由饮水,术后自由活动,禁食禁水;健康昆明种小白鼠150只,体重(20±2)g,雌雄兼有,由哈尔滨医科大学第二附属医院试验动物场提供。1.2方法1.2.1外部环境活性测定采用试管二倍稀释法。相同过程重复4次。1.2.2抗肠毒素作用1.2.2.中草药提取液与cayn培养液的比例关系将E.coli接种于普通琼脂斜面培养基,37℃培养12h,再移植于蛋白胨水中,37℃培养12h。在加有CAYE培养液的锥形瓶中采用无菌方法按1∶0.4(v/v)的比例加入中草药提取液并调整所含培养液成分的含量、pH及渗透压,使其与不加中草药提取液对照组的CAYE培养液一致。再按10∶1(v/v)的比例加入上述蛋白胨水12h培养物,同时加入微量葡萄糖使其终浓度为2.5g/L。37℃以170r/min连续有氧震摇培养18h,培养物取出后加入0.1g/L的硫柳汞过夜杀菌,以4℃10000r/min离心30min,收集上清液4℃冰箱保存备用(不超过3d)。1.2.2.llt+0.4ml小孔率提取液及药物治疗自盲肠游离端的回肠开始,沿向心方向用4号丝线结扎肠袢,注射段4cm,间隔段2cm。每个肠袢随机注入1mLLT+0.4mL中草药提取液或1.4mL提取液的培养物,对照组注入1mLLT+0.4mL生理盐水,上述每种液体各注射6个肠袢。注射完毕后缝合腹壁。11h后扑杀试验兔,取出结扎肠袢,测定每个肠袢的长度(cm)和液体蓄积量(mL),并求出二者的比值(mL/cm),根据二者的比值判定中草药提取液抗肠毒素作用的强弱。1.2.3抗药性腹泻的作用小鼠50只,随机分成5组,每组10只。方法主要参照文献。1.2.4影响结肠的进行运动小鼠50只,分组情况同前。方法主要参照文献。1.2.5对小鼠作为小鼠的感染效果小鼠50只,分组情况同前。各药物组小鼠分别灌服相应的中草药提取液0.3mL/只,对照组灌服等量生理盐水。给药后40min,每鼠尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水0.1mL,随后腹腔注射0.6%醋酸生理盐水溶液0.2mL。0.5h后将小鼠脱颈椎处死,剪开腹部皮肤肌肉,用生理盐水分数次冲洗腹腔,用吸管吸出冲洗液,合并后定容至10mL,3000r/min离心15min。取上清液用分光光度计于590nm测定吸光度值,并于标准曲线上查出每只小鼠腹腔渗出的染料量。对照组和药物组小鼠腹腔渗出的伊文思蓝的量之差与对照组小鼠腹腔渗出的伊文思蓝的量之比即为抑制率。根据小鼠腹腔渗出的伊文思蓝的量及抑制率即可判定中草药对炎性渗出的抑制作用。1.2.6处理数据采用SAS6.12进行统计分析。2结果2.1室外抗菌活性结果见表1。2.2对失血肠的毒力将中草药提取液加入到细菌培养液中与大肠杆菌一起培养,用所得培养物LT进行兔回肠结扎试验,结果见表2。连翘及复方组可极显著地(P<0.01)减少LT所致肠袢液体蓄积量;同样方法处理过的板蓝根或大青叶则可显著地(P<0.05)减少结扎肠袢的液体蓄积量。将中草药提取液及LT一起注入结扎肠袢,观察其直接的抗肠毒素作用。表3所列数据表明,与对照组相比,败酱草可显著地减少液体蓄积量(P<0.05),而其它单味药及复方提取液未达到显著水平。2.3小鼠腹泻次数和腹泻频率的比较,见表1表4的结果表明,中草药复方制剂能明显地减少蓖麻油引起的腹泻发生率和腹泻频率。与对照组比较,在1~3h内复方组极显著地(P<0.01)降低了小鼠腹泻次数;在同一时相内,败酱草及复方组的腹泻发生率有降低的趋势,其它单味中草药在对抗蓖麻油所致小鼠腹泻方面差异不显著。2.4不同推进率板蓝根作用表5的数据显示,各药物组均不同程度地减少了小鼠小肠墨汁推进率,其中,板蓝根作用最强,与对照组相比,差异极显著(P<0.01);其次是复方组和连翘组,抑制率分别为13.11%和8.20%,但未达到显著水平(P>0.05)。2.5小鼠合成安物量由表6可以看出,与对照组相比,复方组极显著地抑制了醋酸所致小鼠腹腔染料渗出(P<0.01),抑制率达58.65%;败酱草和板蓝根可显著地(P<0.05)抑制醋酸所致小鼠腹腔染料的渗出,抑制率分别为35.86%和35.02%。3中草药的抗腹泻作用3.1试验所用的大肠杆菌接种物的浓度为1.5×105/mL,在试验中尽可能保证培养基、培养温度、培养时间及判断标准的一致,以确保试验结果有较好的重复性。与西药不同,中草药有颜色,清晰度差,易干扰试验结果的判定,因此本试验中所设阴性对照并非常规的培养基对照而是含有药液的培养基,以消除上述不利因素,确保结果判定的准确性。清热类中草药板蓝根、连翘、败酱草对大肠杆菌O149K88都显示出不同程度的体外抗菌活性,由它们组成的复方的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度较单味药均有所增强,表明这几味中草药在抗菌活性方面具有协同作用。3.2在特定环境及宿主条件下,定居在仔猪小肠内的大肠杆菌产生的肠毒素是引起下痢的直接原因。在ETEC产生的两种肠毒素中ST无免疫原性,作用迅速但较短暂,而LT是一种大分子的蛋白质,有抗原性,虽然作用较迟但持续时间较长,被认为是在大肠杆菌致腹泻中起重要作用。因此,运用热敏肠毒素进行抗肠毒素试验来筛选中草药,对开展仔猪大肠杆菌性腹泻的防治研究具有重要的理论意义和实践意义。3.3将中草药提取液加入到培养液中培养大肠杆菌,或直接与LT一同注入结扎肠袢可明显降低大肠杆菌培养物上清液所致的肠袢液体蓄积量。中草药提取液可能通过以下3种方式发挥作用:(1)在培养过程中,由于中草药的杀菌作用使培养液中的大肠杆菌数目减少,产生LT的量也随之减少;(2)中草药能抑制培养液中存活的大肠杆菌产生LT,致使LT的量减少;(3)中草药对大肠杆菌肠毒素LT有直接的拮抗作用。3.4张明发等曾在研究中草药的抗炎和抗腹泻作用时提出“炎症介质是一类致泻性自体活性物质,临床所见的大多数腹泻性疾病和泻药都是通过致病因子使肠道发生炎症,释放出各种炎症介质所致,因此药物可以通过对抗炎症过程产生止泻效果。”患大肠杆菌性腹泻病的仔猪消化机能紊乱,致使细菌、肠毒素和各种有毒产物作用于肠黏膜引起炎症,肠道的炎症过程又促进液体从肠壁向肠腔渗出而加重了泻下。试验选用的中草药为清热类药物,具有清热解毒抗菌消炎的功效,对病毒感染也有抑制作用。试验结果表明,无论单味药(板蓝根或败酱草)还是复方,均能显著或极显著地抑制醋酸所致的小鼠腹腔毛细血管通透性增高,也就是说,它们对急性炎性渗出过程有抑制作用。3.5小鼠药物性腹泻模型和小鼠小肠推进运动试验是研究药物抗腹泻机理常用的方法。下痢仔猪表现为肠炎的变化,且主要的病变部位是在小肠。蓖麻油是刺激小肠性致泻剂,通过促进炎性介质的合成和释放,致使肠腔积液,肠蠕动加快,而导致腹泻。连翘、板蓝根、败酱草所组成的复方配伍能极显著地减少蓖麻油所致的小鼠腹泻频率,腹泻发生率也较对照组和其它药物组有所降低,表明该复方具有较好的抗炎止泻之功效。几种中草药均不同程度地减少了小鼠小肠墨汁推进率,板蓝根极显著地抑制了炎性产物刺激下的肠蠕动加快,表明抑制肠运动也是中草药抗仔猪大肠杆菌性腹泻的机理。3.6本试验结果证明,板蓝根、连翘