专题一 1.2 基因工程的基本操作程序

1．2基因工程的基本操作程序

目的基因的获取1．目的基因的概念：主要指编码____________的基因。蛋白质2．目的基因的获取途径：(1)从基因文库获取。

①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入__________的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。②部分基因文库：只包含一种生物的一部分基因，如cDNA文库。(2)利用________技术扩增。(3)通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。受体菌PCR基因表达载体的构建——基因工程的核心1．目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可在下一代的细胞中________和发挥作用。2．基因表达载体的组成：目的基因、__________、终止子、标记基因等。表达启动子将目的基因导入受体细胞1．转化的概念：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和________的过程。 2．将目的基因导入植物细胞：(1)常用方法：________________法。(2)其他方法：基因枪法、花粉管通道法等。3．将目的基因导入动物细胞：常用的技术是显微注射技术。4．将目的基因导入微生物细胞：表达农杆菌转化目的基因的检测与鉴定1．目的基因的检测：利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无。2．目的基因表达检测：(1)利用分子杂交技术检测目的基因的______________。(2)利用________________检测目的基因的翻译。3．个体生物学水平鉴定：抗虫或抗病的接种实验。转录抗原－抗体杂交

利用PCR技术扩增目的基因1．PCR——聚合酶链式反应：(1)PCR：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。(2)目的：获取大量的目的基因。(3)原理：双链DNA复制的原理。(4)需要条件：模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)、缓冲溶液。

(5)方法：DNA受热变性解旋为单链、冷却后引物与单链相应的互补序列结合、在DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。 (6)特点：指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。 (7)过程：变性→复性→延伸(重复)。PCR技术DNA复制相同点原理DNA双链复制(碱基互补配对)原料四种游离的脱氧核苷酸条件模板、酶等不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)

细胞内含有的DNA聚合酶结果

在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子2．DNA复制与PCR技术的比较：基因工程的核心——基因表达载体的构建1．表达载体的组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因。下图是表达载体的模式图：(1)启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别和结合的部位。(2)终止子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。它使转录在所需要的地方停止下来。

(3)标记基因：一种已知功能或已知序列的基因，起着特殊标记的作用，用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因(目的基因是否导入成功)。如抗生素基因或荧光基因等。2．构建方法：(1)切割质粒和目的基因的限制酶必须是同一种酶，以获得相同的黏性末端，利于重组质粒的构建。

(2)将切下的目的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。受体种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2+处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti 质粒的T—DNA 上→农杆菌→导 入植物细胞→整 合到受体细胞的 DNA→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取 卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状 的动物

Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细 胞吸收DNA分子比较不同受体种类的目的基因的导入方法真核生物的基因导入细菌细胞后，不能正常发挥功效的可能原因有：(1)被细菌体内的限制性内切酶破坏。(2)该基因指导合成的蛋白质不能在细菌体内正确修饰和表达。(3)细菌的RNA聚合酶不能识别真核基因的位点，致使不能启动转录。类型步骤检测内容方法结果显示分子检测

第一步(导入检测)

转基因生物染色体的DNA上是否插入了目 的基因DNA分子杂交(DNA和DNA之间)是否成功显示出杂交带

第二步(转录检测)目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术(DNA 和mRNA之间)同上

第三步(翻译检测)目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交同上个体水平鉴定/①确定是否具有抗性及 抗性程度②基因工程产品与天然产品的活性是否相同①抗虫或抗病的接种 实验②基因工程产品与天然产品活性的比较是否赋予了预期抗性或蛋白质活性目的基因的检测与鉴定技术的对比注：基因工程成功的标志是目的基因的表达，即目的基因能翻译成所需的蛋白质。

目的基因的获取【例1】在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获得该基因的最佳方法是()A．用mRNA为模板反转录合成DNAB．以4种脱氧核苷酸为原料人工合成C．将供体DNA片段转入受体细胞中，再进一步筛选D．由蛋白质的氨基酸序列推测mRNA

【名师点拨】现在已知的条件只是某小片段基因的碱基序列，而没有相应的mRNA和蛋白质的氨基酸序列，所以只能以4种脱氧核苷酸为原料来人工合成。【答案】B【配对练习1】以下关于PCR技术的说法中，不正确的是()

A．生物体内DNA的复制也称为PCR B．该技术操作过程中要遵循碱基互补配对原则 C．PCR