低分子肝素钙的制备

低分子肝素钙的制备

肝醇是广泛存在于动物器官和组织（如肠粘膜、肺等）中的一种葡萄糖聚糖。它具有抗凝、抗炎、抗过敏、抗癌、抗癌、调节血脂等多种药理活性。但长期使用会导致一些副作用，如出血和诱导血小板减少。低分子肝素(lowmolecularweightheparin,LMWH)是肝素分级或降解而得到的分子质量较小的片段。近10年来,人们对低分子肝素的研究发现,其抗血栓作用优于肝素,具有生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小,口服易吸收等特点。由于低分子肝素有效性和安全性均优于普通肝素,目前已成为肝素类药物研究的热点。普通的肝素类产品都是钠盐型,与钙盐型相比,后者又具有皮下注射时局部血肿现象减少和疼痛状况明显改善等优点,故目前肝素类产品更倾向于制成钙盐型。作者以市售注射用肝素钠为原料,经过亚硝酸钠降解成低分子肝素钠,经过732阳离子交换树脂转型,氧化钙中和,制备低分子肝素钙(minihepcalcium)。1材料和机器1.1化学试剂及标准品肝素钠(注射级,效价:201U,常州生化千红制药有限公司生产);001×7型阳离子交换树脂(732,沈阳市东兴试剂厂生产);SephadexG—75(上海化学试剂站生化分厂分装);低分子肝素标准对照品(EPCRS,平均分子质量为3700,欧州药典委员会生物标准品中心生产);氧化钙(AR,上海奉贤奉城试剂厂生产);亚硝酸钠、氢氧化钠、硫酸、硫酸钠、无水乙醇、丙酮均为AR级(沈阳正新高科技研究所试剂部生产)。1.2软件接口和简介日本岛津LC—10ADVP泵;RI—6A示差折光检测器;SPD—M10ADVP二极管阵列检测器;CBM—10A接口;DGU—4A脱气装置;CTO—10ADVP恒温柱箱;CLASS—LC10系统软件和GPC专用软件;ShodexAsahipakGF—510HQ(7.6mm×300mm)色谱柱;半微量凯氏定氮装置。2方法2.1分离纯化碘化钾将5g肝素钠溶于100mL蒸馏水中,按文献设计了两因素三水平的反应条件,两因素即亚硝酸钠的浓度(A)及pH值(B),按表2的条件进行正交实验,于室温下搅拌,淀粉碘化钾试纸监测呈阴性,反应完毕。用10mol/L氢氧化钠溶液调节反应液的pH值至7.0,在黑暗条件下用紫外线(254nm)照射15min。SephadexG—75柱层析;柱规格2.2cm×52cm;上样量:0.5mL;洗脱液:0.2mol/L氯化钠溶液;流速:0.5mL/min,以高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)检测流出组分的分子质量。逆向流水透析48h,透析液适当浓缩。结果见表1、2。2.2脱钠按文献,在搅拌下向“2.1”条所得液中加入已预处理过的732阳离子树脂,直至pH值恒定在1.0,过滤得滤液。2.3氯化钙溶液的配制冰浴条件下向“2.2”条所得滤液中加入氧化钙粉末至全部溶解,pH为7.0时,搅拌下按表3所示各浓度加入氯化钙粉末全部溶解,放置4℃冰箱过夜。过滤,向滤液中缓慢加入乙醇(体积比2∶1),离心,收集沉淀,用适量乙醇、丙酮洗涤,脱水,60℃下真空干燥4h。2.4色谱柱及检测波长色谱条件为ShodexAsahipakGF—510HQ(7.6mm×300mm)色谱柱;流动相:硫酸钠(取无水硫酸钠2.84g,加水溶解并稀释成100mL,用1mol/L硫酸调解pH值至5.0);流速:0.5mL/min;检测波长:234nm;柱温35℃。2.4.1差色谱保留时间的测定取低分子肝素标准对照品(EPCRS)20mg,加流动相2mL溶解,取25μL,注入液相色谱仪,记录示差色谱图与紫外色谱图,准确测定对照品在两种检测器中流出的时间间隔,以确保两者的色谱图能够一致,以示差色谱的保留时间计算结果。2.4.2计算分子质量取样品20mg,加流动相2mL溶解,取25μL,注入液相色谱仪,记录示差色谱图,相对分子质量记算如下:r=∑RI/∑UV234F=Mna/rM=F(RI/UV234)Mw=∑(RIiMi)/∑RIir为归一化因子;∑RI为对照品示差色谱峰的总面积;∑UV234为对照品紫外色谱峰的总面积;F为计算因子;Mna为对照品的数均分子质量;M为色谱峰上某一点所对应的峰高;RI为示差色谱图上某一点所对应峰高;UV234为紫外色谱图某一点所对应的峰高;RIi为流出组分i的物质量,即示差色谱图的峰高;Mi为与组分i相对应的分子质量,即示差色谱图时间点代入标准曲线获得分子质量。结果见表2。2.5用硫酸根离子和酸根离子的摩尔比确定2.5.1阳离子交换树脂电导法取样品约0.1g,加水20mL溶解后,吸取2mL通过732阳离子交换树脂柱(约10cm×1cm),用10~15mL去离子水缓缓洗入滴定容器,进行电导滴定,每次加氢氧化钠溶液(0.05mol/L)50μL,直至终点。2.5.2各条直线的衔接以电导为纵坐标,滴定的体积为横坐标,绘制曲线。分别对突然下降,稍微爬升,急剧上升的2个线性部分图形作出最佳直线,在第1条直线和第2条直线、第2条直线和第3条直线的交点,分别对横坐标作垂直线,第1条和第2条直线交点给出硫酸根消耗氢氧化钠溶液(0.05mol/L)亳升数(V1),第2条和第3条直线交叉给出硫酸根离子与羧酸根离子共同消耗氢氧化钠溶液(0.05mol/L)的毫升数(V2)。硫酸根离子的摩尔/羧酸根离子的摩尔=V1/(V1/V2)。结果见表2。2.6其他相关因素的检测总氮量及钙含量的测定依照《中华人民共和国药典》。结果见表2、3。3低分子端纤维素的降解低分子肝素无论是抗凝活性还是抗栓活性都是以肝素与抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)相结合为前提的,该结合要求肝素必须有一个五糖单位(见图1),此结构为肝素抗FXa及抗FⅡa活性所必须。此外,抗FⅡa活性不仅在五糖上与ATⅢ结合,还必须在十三糖上与ATⅢ结合才能表达,所以抗FXa及抗FⅡa活性与由肝素制成的低分子肝素的降解程度关系密切。如果肝素降解后只剩下五糖单位,那么制成的低分子肝素只能具有抗FXa的活性,如果五糖单位也被降解了,那么抗FXa的活性也将丧失,所以以肝素为原料降解制备低分子肝素时,反应条件要控制准确,保证所得的低分子肝素相对分子质量不低于2000。Barnett指出亚硝酸盐在0.01%~0.1%范围内,可以较好地控制肝素的降解程度,或通过控制亚硝酸盐和肝素的比例,也可以得到预想分子质量的低分子肝素。而残余的亚硝酸盐可以通过超滤或紫外线照射(254nm)除去。根据欧州药典,低分子肝素分子质量及其分子质量分布的标准为平均分子质量应小于8000,且该类组分不得小于60%,肝素降解制备低分子肝素时,作者根据文献设计了两因素三水平的正交实验,以保证分子质量符合要求。由降解机制可知(见图2),硫酸根离子与羧酸根离子的摩尔比及总氮量都反应了降解的程度,都是对降解程度的进一步测量。用732阳离子树脂脱钠,pH值为1.0时,钠离子可与H+充分交换,包括透析不完全残余的钠,过滤,滤液用氧化钙中和,则得到低分子肝素钙盐型,钙的结合量被后加入的氯化钙所促进,根据部颁标准,钙的百分率应在9.5%~11.5%,根据规定设计了各种浓度的氯化钙以促进钙离子的百分含量,因此设计了各种浓度进行考察,结果见表3。由表3的实验结果可以得出以下结论:降解反应的pH为2.5时,降解后所得分子质量偏小,pH3.0时,所得分子质量偏大。pH值为2.8时,亚硝酸钠的浓度为0.285mol/L时,降解产物的分子质量趋于中间数量级,分子质量大于8000和小于2000的相对较少,而且硫酸根离子与羧酸根离子的摩尔比及总氮量的数值也在标准的中间值,因此在此降解条件下进行肝素降解反应,可以得到比较理想的低分子肝素的分子质量分布,硫酸根离子与羧酸根离子物质的量比及总氮量的数值也较理想。降解反应后,进行钙盐转型,先用