荧光原位杂交技术在基因鉴定中的应用

荧光原位杂交技术在基因鉴定中的应用

dap是2世纪8年代初在原含辐射原交技术的基础上发展起来的一种非辐射原交技术。bauman在荧光后标记rna，作为研究数据进行注入。其基本原理是用已知的标记单链核酸为探针,按照碱基互补的原则,与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合,形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列,因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因定位在染色体上。与传统的放射性标记原位杂交相比,荧光原位杂交具有安全、快速、灵敏度高、检测信号强、杂交特异性高、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示间期核。1分子杂交和非放射性标记检测荧光原位杂交技术是在同位素原位杂交技术的基础上发展起来的.1969年Gall和Pardue及John等分别独立建立了同位素原位杂交技术。1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来,提高了基因定位的准确性。1975年,Manning等人最先在溶液的分子杂交中,使用非放射性标记,通过细胞色素C将生物素与RNA分子连接起来。1977年Rudkin等发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA的非同位素原位杂交技术。1981年Roumam首次报道了荧光素标记的cDNA作原位杂交。同年,Langer等用生物素标记核苷酸制备探针。1986年,Cremer与Lieher等分别证实了荧光原位杂交(FISH)技术应用于间期核检测染色体非整倍体的可行性,从而开辟了间期细胞遗传学研究。2中期染色体fish的再向fiber-fish的发展趋势在20世纪90年代,FISH在方法上逐步形成了从单色向多色、从中期染色体FISH向粗线期染色体FISH再向fiber-FISH的发展趋势,灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高。以下简单介绍近年来FISH技术的发展。2.1sh的染色体特征是用全染色体或区域特异性探针,通过多彩色FISH使中期细胞特异染色体和间期核呈现不同荧光颜色的条带,从而分析染色体的方法,常用于识别染色体重组、断裂点分布、鉴别染色体外核物质的起源。2.2间接标记检测是用寡核苷酸作为引物,原位PCR扩增待测序列,并在此过程中掺入荧光素直接或间接标记的核苷三磷酸,使扩增出的序列都得以标记。通过几轮这样的扩增,使待检的几个序列的原位扩增产物标记上不同荧光素,实现同时对多个微小缺失和突变等染色体微小改变的检测。这方法已常规用于检测特异性a卫星序列在染色体和间期核内的定位。2.3检测正常中期染色体的强度是在荧光原位杂交基础上结合消减杂交技术于9O年代发展起来的一种新的分子细胞遗传学技术,CGH以不同荧光标记待测和参照细胞群的等量基因组DNA,并用加入一定量的人竞争DNA(Cot-1DNA)抑制分散重复序列(interspersedrepetitivesequence,IRS)。不同标记的DNA同时与正常中期染色体杂交,结果正常染色体每个位点上的两种荧光强度之比反映待测与参照基因组DNA序列的拷贝数之比。这个方法最大的优点是:在一个实验中完成一个样本全部染色体丢失和获得的检测,并且不需要分裂细胞。主要的缺点是分辨率不高,可以检出的缺失大小约5~10Mb;另外,不能检测出没有基因组拷贝数明显变化的染色体平衡易位、倒位及全基因组的整倍体改变。与FISH相比,CGH在一次实验中能对肿瘤样品中整个基因组中的DNA扩增和缺失等变异获得整体认识,并描绘出相应的CGH核型图,可在物种间进行染色体同源性比较,从而弥补了常规FISH只适于小部分肿瘤的不足。2.4用流变剂进行染色加工游离染色质丝尽管已经失去了原有的细胞空间结构。但它仍是DNA和蛋白质的复合大分子。其染色质的基本结构核小体和组蛋白并没有遭到破坏.在Heng等人的思路的基础上,Wiegant、Parra和Windle进一步想到用更强的变性剂对染色质丝进行处理。让DNA分子完全从蛋白质中分离出来,制备出DNA纤维。Wiegant等用一种含高浓度盐和一定量的变性剂的碱性缓冲液对间期细胞核进行处理后.得到一种被称为Halo的DNA纤维结构围绕在细胞核周围.这是一些环状DNA分子片段.通常有400~500kb长,可以用来作为高分辨率的FISH的靶DNA,就是最初的纤维-FISH。纤维-FISH具有高分辨率,能进行定量分析,模板要不高,只需分析少量的DNA分子,灵敏度高等优点。由于纤维-FISH的这些优点,使得它在染色体图谱绘制,基因重组研究以及临床染色体基因序列检测工作中起着十分重要的作用。2.5荧光免疫核型分析和间期细胞遗传ring-FISH它利用多聚核苷酸探针,第一次允许检测质粒上的单个基因或基因片段以及单个细胞中的核酸,这种方法的杂交信号特征包含一个像光晕、圆圈形状的荧光聚集在细胞周边。荧光免疫核型分析和间期细胞遗传学是一种将免疫核型分析和原位杂交相结合的方法,这种方法可以同时显示异种细胞群中单个肿瘤细胞的免疫表现型和一定的基因改变。这种方法和形态学有关,可以对档藏材料作回顾性研究。其优点是诊断快速,可以再现,适合FISH分析前或后没有所需以前细胞标本的细胞学样本。3fish技术的应用3.1fish的检测Hogardt等利用FISH技术直接检测临床标本,使用成套设计的针对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、洋葱假单胞菌等痰标本中常见菌的寡核苷酸探针,较传统培养法相比,可达90%的敏感性和近100%特异性。这提示我们FISH成套探针可用于特定疾病相关性病原体的检测。Poppert等用电子显微镜、直接荧光染色和FISH检测感染了沙眼衣原体和肺炎衣原体的HeLa229细胞,发现在感染后6h可用电子显微镜观察到细胞内有衣原体形成;FISH在感染后12小时至第6天,均能检测到衣原体;而直接荧光染色检测到衣原体时间要晚于FISH。这提示FISH可快速且准确的检测衣原体感染。而Kapur等则联合应用PCR和FISH直接检测泌尿生殖道拭子标本128份,其中FISH的阳性率为21.8%(28/128),PCR的阳性率为25.7%(33/128),说明FISH在检测衣原体感染方面具有高度的特异性和较好的敏感性。3.2fish的优点FISH的优势是不仅适用于分裂中期的染色体,也适用于间期核及细胞周期的所有阶段。FISH分析无需作细胞培养及显带分析,仅做细胞计数;而常规的细胞遗传学检查,常受分裂相数量、质量、显带技术及个人技能的影响。FISH的突出优点是可以快速得出结果。与历时7~12d的传统染色体显带分析相比较,FISH分析可在24h内完成,让医生尽早做出诊断,制定诊疗方案。与放射性原位杂交相比较,FISH技术无放射性同位素污染,不需要特殊的安全防护,且敏感性与同位素检测相当。FISH探针特异性在于FISH探针可以有针对性地检测小的单一序列、着丝粒特异序列和整条染色体,并用已验证核型分析的推断和进一步鉴定显带法未能确定的标记染色体,对嵌合型的诊断,FISH比传统的显带法核型分析更可靠。FISH杂交信号明亮,灵敏度高,特异性强,与传统的细胞遗传学核型分析的符合率高达99.8%,是一种灵敏准确的分子细胞遗传学技术。3.3fish技术检测alu位点基因的染色体定位是FISH技术在分子生物学上的重要应用。应用高分辨FISH结合CCD相机的计算机图像分析研究A1u(短散布元件shortinterspersedelement,SINE)和Ll(长散布元件longinterspersedelement,LINE)序列在人中期染色体上的布分,发现Alu序列主要在R带,Ll序列主要是O/Q深染带。FISH技术与生化、计算机和重组DNA技术结合检测Alu位点。表明DNA序列与带型有关。用FISH技术对人类基因组中编码基因分布的研究揭示,基因主要集中在染色体上G+C(占金基因组35%)最丰富的DNA区段。3.4体间相互作用FISH可以直接观察染色体端粒,简化了对其在核内的结构和功能究.Werner等用FISH证实在普通小麦等物种中所有缺失染色体的断裂端都存在端粒序列,认为在小麦中可能存在染色体重新修复机理,在断裂端添加端粒序列,而“端粒捕获”则可以稳定染色体的损伤,从而解释了人类恶性肿瘤中亚端粒易位的高发生率的原因,这种相互易位最初认为是亚端粒缺失。3.5结构的优化设计用FISH可直接检测DNA在染色体上的位置,由于原位杂交不受位点内变异和位点间拷贝数的影响,FISH已成为重复序列和多基因家族作图的重要手段,它所确定的位置是基因在染色体上实际的物理位置。Ruault等用FISH将TRX/MLL基因家族中的MLL3定位于7q36,这一区域在骨髓瘤白血病中常常缺失