分子生物学课件：第六章 基因工程

第六讲基因工程

同步练习：P191-196胰岛素依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素。

胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！价格降低30%-50%!干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。

基因工程人干扰素α-2b（安达芬）是我国第一个全国产化基因工程人干扰素α-2b，具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。

+操作简化过程—DNADNA重组DNA表达产品20世纪70年代初DNA已可在体外被随意拼接并转回到细菌体内遗传和表达。今天，超市保持期很长的转基因番茄“多利”克隆绵羊1999年我国转基因水稻、玉米、小麦、番茄、白菜、甜菜、木瓜、花生等已进行田间试验。2001年我国获准环境释放的转基因食品已达58种，其中水稻9项、马铃薯8项，番茄和玉米各4项，黄瓜2项，大豆和辣椒各1项。转基因抗虫棉，赖氨酸的含量提高30%的转基因玉米，转基因延熟番茄，转基因矮牵牛，耐寒植物(番茄等），抗除草剂植物（大豆等），基因工程药物（白细胞介素-2，干扰素，乙肝疫苗等）一、基因工程的历史（2）50年代搞清楚了DNA的双螺旋结构和

半保留复制机理。（1）40年代发现了生物的遗传物质是DNA。（3）60年代确定了遗传信息的传递方式。理论上的三大发现技术上的三大发明（3）基因工程载体（vector）的发现（2）DNA连接酶（ligase）的发现（1）限制性核酸内切酶（restrictionenzymes）的发现基因工程的操作是很简单的，但其中涉及到许多关键性技术，如:不同生物来源的DNA分子的切割与连接、DNA拼接反应的检测方法重组DNA分子导入受体细胞的方法等。

1972年猿猴病毒基因组SV40DNA、λ噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年，体外构建出含有四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒分子，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的诞生。1.基因工程的诞生正如Cohen在评价其实验结果时指出的那样，基因工程技术完全有可能使大肠杆菌具备其他生物种类所固有的特殊生物代谢途径与功能，如光合作用和抗生素合成等。

2.基因工程的成熟1977年，日本的Tfahura及其同事首次在大肠杆菌中克隆并表达了人的生长激素释放抑制素基因。1978年，美国Genentech公司开发出利用重组大肠杆菌合成人胰岛素的先进生产工艺，从而揭开了基因工程产业化的序幕。

这一时期主要基因工程产品的研制开发生产简况如下表

产品首次克隆国家用途首次进入国家/地区表达时间市场时间人生长激素释放抑制素1977日本治疗巨人症人胰岛素1978美国治疗糖尿病1982欧洲人生长激素1979美国治疗侏儒症，延防衰老1985美国人α-干扰素1980美国/瑞士治疗病毒感染症1985欧洲乙肝疫苗1983美国预防乙型肝炎1986欧洲人白细胞介素-21984日本治疗肿瘤1989欧洲人促红细胞生成素治疗贫血1988欧洲人粒细胞集落刺激因子

治疗中性白细胞减少症1991美国人组织纤维溶酶原激活剂治疗血栓症1987美国3.基因工程的腾飞

20世纪80年代以来，基因工程已开始朝着高等动植物物种的遗传特征改良以及人体基因治疗等方向发展。1982年，美国科学家将大鼠的生长激素基因转入小鼠体内，培育出具有大鼠雄健体魄的转基因小鼠及其子代。1983年，携带有细菌新霉素抗性基因的重组Ti质粒转化植物细胞获得成功，高等植物转基因技术问世。二、基因工程的基本概念基因工程DNA重组技术克隆DNA克隆狭义讲：基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，表达出新产物或新性状。广义讲：是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即狭义基因工程）；下游技术：基因工程菌（细胞）的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化与鉴定等过程。基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。DNA重组技术在体外将不同来源的DNA分子通过磷酸二脂键连接成一个新的DNA分子。单一基因或DNA片段的大量拷贝。因DNA操作的多是特定的基因，故也称基因克隆。DNA克隆克隆即来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。DNA克隆即应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。三、基因工程的特征跨物种性外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。无性扩增外源DNA在宿主细胞内可大量扩增，和高水平表达。支撑技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应技术DNA序列分析技术酶学技术细菌转化转染技术核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术（一）工具酶（二）载体（三）宿主细胞四、基因工程所需材料(元件)（一）工具酶基因工程中的许多工作都涉及到对DNA进行切割和重组，或对DNA进行修饰或合成。这些工作都是通过酶的作用来完成的。切割、合成、连接、修饰等各种工具酶都是必不可少的。基因工程的工具酶（instrumentalenzymeofgeneengineering）是应用于基因工程各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体DNA制备等所需要的酶类。限制性核酸内切酶DNA聚合酶末端转移酶T4核苷酸激酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶DNA酶I细胞壁裂解酶蛋白酶K

限制酶（restrictionenzyme）是一类内切核酸酶，因而又称为限制性内切核酸酶。这类酶能识别双链DNA内部特异位点并且裂解磷酸二脂键。1.限制酶定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别双链DNA分子内部的特异序列,并在识别位点或其周围切割DNA的核酸水解酶。功能主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵。（1）限制酶的种类根据酶结构、作用及与DNA结合和裂解的特异性，将限制酶分为三型.Ⅰ型酶具有限制和DNA修饰作用，这种酶通常在识别位点下游100～1000bp处切割DNA。Ⅲ型酶与Ⅰ型酶一样，具有限制与修饰活性，能在识别位点附近切割DNA，切割位点很难预测。

Ⅱ型酶是基因工程中最重要的工具酶，它能在DNA分子内部的特异位点识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。通常所说的限制酶就是指这一类酶。

所以,在基因克隆中,Ⅰ型和Ⅲ型酶都没有多大的实用价值。限制性核酸内切酶主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATP、Mg2+、SAMMg2+ATP、Mg2+、SAM切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处

（2）限制酶的命名a.第一个字母为该酶的细菌属名,大写;b.第二、三个字母为该细菌的种名，小写；c.第四个字母代表株;d.用罗马数字表示酶的编号（现常用来表示发现的先后次序）例：EcoRⅠE代表Escherichia属，co代表coli种，R代表RY13株，Ⅰ代表该菌株中首次分离到的内切核酸酶。

EcoRV第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

平端切口、黏端切口实质：破坏磷酸二脂键GGATCCCTAG（3）限制酶的作用模式4～6碱基对大多数酶是错位切割双链DNA，产生5′或3′黏性未端（cohesiveend）。如EcoRⅠ切割后产生5＇黏性末端：5′-GAATTC-3′3′-CTTAAG-5′5′-G3′-CTTAAAATTC-3′G-5′5′-GGATCC-3′3′-CCTAGG-5′5′-G3′-CCTAGGATCC-3′G-5′BamHI：GATATCCTATAGGATATCCTATAGEcoRV有些酶则产生平头末端，如EcoRV5′…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3′3′…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5′5′…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3′3′…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5′PstⅠ等产生的3′黏性末端5个碱基识别位点：EcoRⅡ↓CCWGG

W=A或T7个碱基识别位点：BbvCⅠCC↓TCAGCBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口黏端切口（4）同功异源酶（isoschizomers）来源不同，识别和切割位点相同。可互相代用。如：BamHⅠ和BstⅠ(G↓GATCC)（5）同尾酶（isoaudamers）产生相同的黏性末端如：BamHⅠ(G↓GATCC)和Sau3AⅠ(N↓GATCN)

商品化的限制酶已有100多种（其切割序列明确）名称识别序列及切割位点名称识别序列及切割点切割后产生5′突出末端:BamHⅠ5′…G▼GATCC...3′BglⅡ

5′…A▼GATCT...3′EcoRⅠ

5′…G▼AATTC...3′HindⅢ

5′…A▼AGCTT...3′HpaⅡ

5′…C▼CGG...3′MboⅠ

5′…▼GATC...3′NdeⅠ

5′…GA▼TATG...3′切割后产生3′突出末端:ApaⅠ

5′…GGGCC▼C...3′HaeⅡ

5′…PuGCGC▼Py...3′KpnⅠ

5′…GGTAC▼C...3′PstⅠ

5′…CTGCA▼G...3′SphⅠ

5′…GCATG▼C...3′切割后产生平末端:AluⅠ

5′…AG▼CT...3′EcoRⅤ

5′…GAT▼ATC...3′HaeⅢ

5′…GG▼CC...3′PvuⅡ

5′…CAG▼CTG...3′SmaⅠ

5′…CCC▼GGG...3′限制性内切核酸酶

基因工程中常用的工具酶有许多是对DNA和RNA分子未端进行剪切、补平、连接及化学修饰的酶，常见的有以下几种：（1）DNA聚合酶Ⅰ

DNA聚合酶Ⅰ是从大肠杆菌中发现的第一个DNA聚合酶，分子量为109kD。

具有5＇→3＇聚合酶活性3＇→5＇外切酶活性5＇→3＇外切酶活性，用于缺口平移法2.修饰酶用枯草杆菌蛋白酶可将DNA聚合酶Ⅰ裂解为大小两个片段，大片段的分子量为76kD，这个片段也称为Klenow片段（Klenowfragment）。具有5＇→3＇聚合酶活性3＇→5＇外切酶活性Klenow片段的主要用途有：①补齐双链DNA的3‘末端。②通过补齐3‘端使3’末端标记。③在cDNA克隆中，第二股链的合成。④DNA序列分析。

（2）TaqDNA聚合酶

具有5＇→3＇聚合酶活性5＇→3＇外切酶活性

无3＇→5＇外切酶活性用于PCR扩增、定量PCR技术（3）逆转录酶（reversetranscriptase）常用的逆转录酶有两种：a.禽类成骨细胞性白血病病毒（AMV）逆转录酶。b.Moloney小鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶。广泛用于以mRNA为模板合成cDNA，构建cDNA文库。

（4）末端脱氧核苷酰转移酶，简称末端转移酶。特性：不依赖于模板的DNA聚合酶

作用：可在单链或双链DNA（至少3个碱基）的3＇-OH（5＇突出或5＇平末端效率低）添加一个或多个核苷酸用于：探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。（5）DNA连接酶1967年发现首个DNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶。1970年发现T4DNA连接酶，大肠杆菌T4噬菌体基因编码。E.coliDNA连接酶-连接具互补碱基黏性末端、平末端;需NAD+辅助因子，活性低，不常用。T4DNA连接酶-连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。T4DNA连接酶催化双链DNA一端3＇-OH与另一双链DNA的5＇端磷酸根形成3＇，5＇-磷酸二酯键，使具有相同黏性末端或平端的DNA末端连接起来。作用特点1.连接的两条链必须分别具有自由3＇

-OH和5＇

-P，而且这两个基团彼此相邻;2.形成磷酸二酯键是一种耗能过程。（6）碱性磷酸酶

活性：去除单链或双链DNA或RNA5＇端的磷酸基团。用途：制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。（7）核酸酶S1一种从米曲霉中分离获得的高度单链特异性外切酶活性：可以降解单链DNA或RNA或双链的单链区。用途：在cDNA合成过程中，切开cDNA的发夹末端;切去DNA的黏性末端形成平末端结构。载体简介定义:是一种在细胞中能够自主复制的、由ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分（复制子），它能够携带外源ＤＮＡ片段（“乘客”）进入指定的受体细胞，并在其中复制扩增或转录或表达。它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。（二）载体2．载体特点——载体应具备的条件①能在适当的宿主细胞中复制；②具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；③具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA插入；④分子量小，以容纳较大的外源DNA；⑤对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。

两种常用的质粒载体结构3.载体的分类1)功能或使用目的克隆载体表达载体克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。2)受体细胞类型3)载体的特性质粒、噬菌体、粘性质粒（粘粒）、酵母人工染色体（YAC）、病毒载体等原核载体真核载体穿梭载体克隆载体常见的载体有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、人工染色体。质粒

(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。A.质粒载体特点：a.分子量小，稳定，高拷贝数；b.有遗传标志，便于选择；c.有多个限制酶的单一切点——多克隆位点，便于外源基因插入。主要用作亚克隆载体（只能容纳小于10kb外源DNA片段）第一个用于基因克隆实验的质粒pSC101就具备上述条件。该质粒是从沙门氏菌中分离出来的，其分子大小为9.09kb。对限制酶EcoRI只具有一个识别位点，而且在这个位点上克隆外源DNA，既不会影响它的复制功能，也不会破坏其唯一的四环素抗性选择记号。pSC101质粒用作克隆载体的缺点是其分子量较大而且拷贝数低。Cohen等(1973)构建第一个质粒载体。pBR322是用人工方法构建的符合理想质粒载体条件的好载体。目前使用广泛的多质粒载体几乎都是由此发展而来的。蓝白斑筛选B.噬菌体载体

λgt系列载体可容纳0-6kb外源DNA片段

EMBL系列载体可容纳20Kb外源DNA

黏粒质粒(cosmid)是λDNA的cos区与质粒重新构建的载体，为双链环状DNA;克隆容量可达40-50kbM13噬菌体(M13phage)是一种大肠杆菌噬菌体采用不对称复制获得大量单链DNA表达载体（expressingvector）将常用克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件（DNA序列），即成为表达载体，不仅可以将外源基因片段携带进入宿主细胞，而且可以在宿主细胞（受体细胞）中表达（转录和翻译）外源基因的载体。这类载体除具有克隆载体所具备的性质以外，还带有表达构件——转录和翻译所必需的DNA序列。表达载体的种类A.大肠杆菌表达载体B.分枝杆菌表达载体C.放线菌表达载体D.酵母表达载体E.哺乳动物表达载体哺乳动物细胞表达载体是从克隆载体上发展起来的,含有必不可少的原核序列。（三）基因工程受体菌或细胞1受体细胞应具备条件2各种基因工程受体及其特性大肠杆菌大肠杆菌用途枯草杆菌枯草杆菌用途链霉菌酵母菌酵母菌用途昆虫细胞（家蚕）哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）哺乳动物细胞（CHO）用途植物细胞（拟南芥、烟叶）植物细胞（拟南芥、烟叶）实验室常用的基因工程受体大肠杆菌用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、 JM101、DH5α

用于接受l-DNA：LE392、ED8654酵母菌毕赤酵母、啤酒酵母哺乳动物细胞CHO五、基因克隆的一般过程基因克隆的过程可形象归纳为：分：分离目的基因切：限制酶切目的基因与载体接：拼接重组体转：转入受体细胞筛：筛选重组体以质粒为载体的DNA克隆过程（一）目的基因的获取——分

1．目的基因概念及其类型

应用重组DNA技术有时是为了分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，或是为了获得感兴趣的表达产物——蛋白质。这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因，或称目的DNA或外源性DNA。

目的基因(targetgene)

cDNA(complementaryDNA)指经反转录合成的、与RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。

基因组DNA(genomicDNA)指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。

2.目的基因的获取①人工合成要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。②聚合酶链反应③通过建立和筛选基因文库分离靶基因——已知基因未知基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌从基因组DNA文库获取目的基因基因文库是指通过克隆方法保存在适当宿主中的一群混合的DNA分子，所有这些分子中的插入片段的总和，可代表某种生物的全部基因组序列或全部mRNA序列，因此基因文库实际上是包含了某一生物体或生物组织样本的基因序列的克隆群体。包括两类：基因组文库和cDNA文库。基因组文库构建图（二）选择与制备合适的基因载体——切目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。（三）外源基因与载体的连接——接即DNA的体外重组。与自然界发生的基因重组不同，这种人工DNA重组是靠DNA连接酶将外源DNA与载体共价连接的。黏性末端连接黏-平末端连接人工接头连接同聚物加尾连接同一限制酶位点连接不同限制酶位点连接优先考虑平端连接连接方式目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连连接受体菌条件：安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

（四）重组DNA导入宿主细胞—转显微注射法直接注入大肠埃希菌体外包装感染法组装噬菌体电穿孔法对数生长期细胞氯化钙法感受态细胞哺乳动物细胞DNA-磷酸钙共沉淀细胞吞噬作用病毒感染法包装病毒脂质体介导法融合作用目前常用的方法：氯化钙法、脂质体介导法（五）重组体的筛选——筛筛选出带有载体的克隆筛选出带有重组体的克隆筛选出带有目的基因的克隆转化所得的克隆重组子的筛选重组子大小鉴定直接筛选间接筛选标记补救筛选质粒载体的α互补筛选√（蓝白斑筛选法）噬菌体包装容量的正性筛选质粒载体的抗性标记筛选√载体筛选同源性分析鉴定（原位杂交）DNA序列分析√DNA鉴定重组子酶切图谱鉴定√翻译产物——Westernblotting转录产物——Northernblotting其他方法——报告基因等√(插入失活法)抗药性标记选择

插入外源DNA片段，使抗性基因失活不能在抗生素中生长。Southern印迹鸡的β肌球蛋白的克隆和检出表达体系的建立：表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化六、克隆基因的表达原核表达原核/真核基因受体细胞真核表达真核基因保持产物的结构稳定表达方式分泌型表达包涵体表达融合表达溶解性好易于分离简化产物的分离操作目的蛋白稳定性高末端完整目的蛋白稳定性高易于分离表达率高易于回收外源基因表达七、基因工程下游技术上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）；上游重组DNA的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想。下游技术：基因工程菌（细胞）的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程。下游过程则是上游重组蓝图的体现与保证。基因工程菌发酵补料分批培养连续