禁水过程中大鼠血清中无机离子和尿素氮的变化

禁水过程中大鼠血清中无机离子和尿素氮的变化

身体水平衡的调节是干旱环境中动物生存的一个重要问题。高渗脱水也包括异常的身体水分布，从而影响正常的生理功能。肾脏通过控制排放的尿量来调节和调节水位，并保持血液渗透的稳定性。近年来的研究表明，水通道蛋白质（aqps）对水和电解质的平衡以及渗透感觉的感受起着重要作用。肾组织中水通道蛋白质的形成不仅与原尿渗透有关，还受基底精氨酸加压（avp）的影响。在这项工作中，我们检测了大鼠血清中有机离子浓度的变化，并使用免疫组织化学方法对大鼠下肢c-fos的发现和肾水平通道2（aqp2）的发现进行了分析，探讨了动物对水条件的适应和变化规律，为研究身体水平衡平衡提供了基础。1材料和方法1.1大鼠的一般情况成年Wistar大鼠24只,体重180～220g(购自兰州大学实验动物中心),室温安静环境下饲养.适应一周后称重,随机分为4组,每组6只,分别为禁水0d,1d,2d和3d组.饲养期间除第一组正常饮水外其他各组完全禁水(正常给食),各组大鼠禁水相应时间后再次称重,1%戊巴比妥钠腹腔麻醉,取其血液、下丘脑及肾脏组织.1.2无机离子及尿素氮浓度检测血液盛于离心管中静置,待血液凝固后离心(3000r/min,10min),收集血清,以全自动血液生物化学分析仪(离子选择电极法、尿素酶法,OlympusAu400,Japan)检测血清无机离子及尿素氮浓度.1.3免疫组织化学取各组大鼠下丘脑及肾脏组织,10%福尔马林溶液固定,常规石蜡包埋,制成6μm的切片.下丘脑切片每隔5张取两张,分两套,一套H.E染色进行核团定位,另一套行c-fos免疫组化染色.将石蜡切片脱蜡至水,采用免疫组化SABC法(链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物试剂盒)检测,DAB显色,苏木精复染,常规脱水、透明、封片、光镜观察并拍照.实验所用的抗体、免疫组织化学试剂盒和DAB显色剂均购于武汉博士德生物工程有限公司.1.4模型检测大鼠pvn表达的面密度值根据Paxino和Watson大鼠脑立体定位图谱对H.E染色切片上的PVN进行定位,以确定核团的主部,并对相应的免疫组化切片进行显微摄像,随机取各组照片5张(×400),采用方格测试系统交点计数法分别测算各组大鼠PVN中细胞阳性表达的面密度值(Sv),公式为:Sv=2Ix/Lc,Lc=SPc·a,其中,Ix为阳性表达的细胞与测试方格的交点数;Pc为测试系统落在参照系的点数;a为方格的两点间距离.1.5免疫c-fos在pvn和aqp2中表达强度的变化用Image-proplus5.0专业图像分析软件(MediaCybernetics)进行图像分析,从每套免疫组织化学切片中选取典型对应面,检测c-fos在PVN中的表达强度及AQP2在肾脏集合管中的表达强度.阳性表达强度以统计场总面积平均光度值(averageopticaldensity,AOD)表示.1.6统计分析统计分析使用SPSS13.0软件,采用单因素方差分析.实验结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示.2结果2.1度和cl-浓度血清无机离子及尿素氮(UN)浓度变化结果见表1.禁水1～3d,Na+浓度分别增加7.69%,12.95%,22.30%;Cl-浓度分别增加10%,17.91%,31.84%;UN浓度分别增加41.97%,51.15%,93.73%.血清P3+与Mg2+在禁水第2d后均有不同程度增加.2.2大鼠pvn中c-fos表达情况免疫组织化学显示c-fos表达阳性细胞核着色,呈棕黄色(图版Ⅰ:1-4).禁水过程中各组大鼠PVNc-fos表达部位的面密度值及平均吸光度如表2所示.在0d组大鼠PVN中c-fos呈弱阳性,随着禁水时间的延长,c-fos在PVN中表达的面密度值逐渐增大,虽然禁水1d组较0d组无明显差异(P>0.05),但其在PVN中表达的平均吸光度与0d组之间具显著差异,禁水2d及3d组较0d组面密度值明显增大,差异极显著(P<0.01).2d组及3d组免疫反应呈强阳性,细胞核深染,与0d组差异极显著(P<0.01).2.3aqp2在脏器脏器集合管中表达的平均吸光度.AQP2在肾脏中的阳性表达位于集合管主细胞的顶质膜及细胞胞浆内,阳性表达部位呈棕黄色(图版Ⅰ:5-8).AQP2在各组大鼠肾脏集合管中表达的平均吸光度如表3所示.禁水1～3d,AQP2表达分别增加29.15%,67.78%,120.58%.3大鼠体重、体重和体重变化的比较Na+和Cl-是维持细胞内外渗透压的重要离子,项光华等研究发现双峰驼于禁水后血清中Na+和Cl-的含量呈升高趋势.在禁水过程中,血清中Na+,Cl-离子浓度在禁水1天即升高,随着时间的延长而进一步升高,而血清中Mg2+,P3+上升较迟,在禁水的第2d升高.血清中Ca2+,K+离子变化不显著.血清中无机离子浓度的变化,影响着体液渗透压的变化和机体对水分的吸收和排出,也起到调节机体水代谢的作用.尿素氮是动物蛋白质代谢的主要终末产物,研究发现用甘露醇使机体脱水,使血液浓缩可导致血液尿素氮增高.各组大鼠血清中尿素氮的浓度随着禁水时间的延长而显著升高,提示血清尿素含量较高.尿素的升高受到多种因素影响,禁水过程中1d,2d,3d组大鼠的体重持续降低(分组前:(202.33±4.72)g,1d:(178.22±6.11)g,2d:(163.67±6.03)g,3d:(150.33±4.16)g),剖开腹腔可见胃中食糜较0d组均有减少.尿素的上升除受机体缺水的影响,也可能与大鼠的摄食量减少,蛋白质代谢增加有关.c-fos是一种即刻早期基因,中枢神经细胞受到特异性刺激后,相应细胞内c-fos将快速表达,c-fos蛋白大量合成并迅速堆积于胞核.多种刺激均可引起神经元c-fos的表达,因此c-fos常被用作神经元功能活动标记物.下丘脑室旁核(PVN)是合成多种神经调节肽的核团之一,参与应激、水与电解质平衡、代谢等多种功能调节.有研究表明脑室内注射高渗氯化钠能够刺激下丘脑分泌精氨酸加压素(AVP)和心钠素(ANP)增多,并诱导c-fos在PVN中的表达,下丘脑PVN的神经元活性可被脑室内渗透压增高而激活;而下丘脑PVN损伤后则可出现尿崩症,它由PVN分泌AVP减少所致.禁水1d,下丘脑室旁核c-fos表达阳性的面密度值变化不显著,但平均光密度增加,提示阳性细胞数量变化可能增多不大,而细胞中表达的量显著增多.2d与3d天组二者均显著增加,且随禁水时间的延续,表达持续增多.本研究结果显示PVN内c-fos表达的面密度值与平均吸光度随着禁水时间的延长而增加,提示一定程度上c-fos的表达可能与机体缺水的严重程度相关.AQP2存在于肾脏集合管主细胞,分布在细胞的顶质膜和胞内小泡内.AQP2在细胞内分布受AVP激素调控.当给予AVP后胞内小泡中的AQP2转移到细胞顶质膜,增加细胞膜的水通透性.AQP2参与肾组织水重吸收的调控,AVP增加集合管水渗透通透性与内髓集合管顶膜AQP2的密度有关.研究表明AQP2基因突变后可使集合管重吸收水的功能异常,继而引起尿崩症,这说明了AQP2在调节