异氟醚、安氟醚诱导麻醉对大鼠边缘系统nos阳性神经元的影响

异氟醚、安氟醚诱导麻醉对大鼠边缘系统nos阳性神经元的影响

氟醚异氟醚和氟醚是目前常用的麻醉剂，但其诱导机制尚不完全清楚。一氧化氮(NO)由L-精氨酸通过一氧化氮合酶(NOS)生成。边缘系统的下丘脑、隔区、杏仁簇核神经元均含有NOS,已有研究证明NO在外周及中枢的不同水平的痛觉调控中起一定作用,并与麻醉作用密切相关。但NO是否参与异氟醚、安氟醚在边缘系统的作用尚无明确的形态学实验证据。本研究拟应用NADPH-d组化法来观察异氟醚、安氟醚麻醉诱导期大鼠边缘系统NOS阳性神经元的改变,探讨大鼠边缘系统部分NOS阳性核团是否参与异氟醚、安氟醚的麻醉诱导作用,并为吸入麻醉药在边缘系统作用机制的研究提供了形态学依据。小鼠脑电nadph-d试剂与仪器异氟醚、安氟醚系雅培公司产品(英国),β-NADPH为Sigma公司产品(美国),氯化硝基四氮唑蓝(NBT)为Flulca公司产品(美国),LeicaCM1100冰冻切片机、LeicaQwin图像分析处理系统由Leica公司(德国)提供。动物模型及分组SD大鼠18只,全部雄性,年龄34月,体重200250g,由徐州医学院实验动物中心提供。将动物随机分为对照组、异氟醚组、安氟醚组,每组6只。对照组动物除不吸入麻醉气体外,其他条件均与异氟醚组、安氟组相同。两组大鼠分别吸入2%安氟醚或2%异氟醚至步态不稳、一侧肢体着地,即翻正反射即将消失时,移出麻醉箱,立即取标本。组织切片各实验动物移出麻醉箱后,立即用乌拉坦麻醉,开胸,经升主动脉灌流固定,断头取脑置于30%蔗糖液中至组织块沉底,持续冠状冰冻切片,片厚40μm,连续取片,隔三取一。安氟醚和异氟醚组分3套切片,第一套用NADPH-d组织化学染色;第二套用中性红普通细胞染色,确定阳性核团的位置;第三套用于阴性对照实验。NADPH-d组化法将切片放入含0.5mg/mlNADPH-d,0.6mg/mlNBT,温育(37℃)1h。将切片移入0.01mol/1PBS液中终止显色反应。常规脱水、透明、封片、光镜观察记数,图象分析并照相。统计学处理数据以均数±标准差()表示,组间比较用t检验,采用SPSS10.0统计软件处理,P<0.05为差异有显著性。安氟醚对大鼠脑边缘中nos阳性神经元的影响各组大鼠边缘系统切片NOS阳性神经元的胞体和突起呈蓝色,显色清楚集中,而胞核不着色,各阳性神经核团在边缘系统为双侧对称分布,无侧偏现象,见图1。NOS阳性神经元以每个核团内的个数表示数量,无论染色深浅,只要显示NOS阳性神经元特征,在低倍和高倍镜下背景区分明确,即予以计数。染色深浅用LeicaQwin图像分析与处理系统进行染色深度分析,用平均灰度水平表示。结果见表1,表2。实验结果表明,大鼠吸入2%安氟醚或安氟醚后,翻正反射消失的潜伏期分别为(2.6±0.5)min、(2.1±0.4)min。安氟醚组鼠脑边缘系统中隔外侧核、杏仁外侧核、下丘脑室周核、下丘脑室旁核、视上核和伏隔核等6个核团NOS阳性神经元数量和平均灰度水平均明显低于对照组(P<0.01)。异氟醚组在上述6个核团中NOS阳性神经元的数量和平均灰度水平也低于对照组,唯下丘脑室周核和视上核NOS阳性神经元数目有减少趋势,但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),其余核团与对照组比较差别均有显著性(P<0.01)。杏仁核与异氟醚、安氟醚的相互作用翻正反射消失是常用的动物麻醉的指标。大鼠吸入麻醉药后步态不稳、翻正反射即将消失时相当于麻醉诱导期。NO作为一种细胞间信使分子,在神经系统作为一种空间信号发挥生物学效应,参与机体伤害感受性传递和维持清醒状态。有研究表明NO-cGMP信息途径可能与全麻药作用机制有关。神经NOS(nNOS)特异性抑制剂7-nitroindazole(7-NI)能使大鼠异氟醚的最低肺泡有效浓度(MAC)呈剂量依赖性降低。冯征等报道异氟醚剂量依赖性抑制大鼠皮层、脑干、海马及小脑突触体NOS活性和NO含量。李元涛报道,安氟醚诱导期能抑制大鼠脑皮质、脑干、海马的NOS活性和NO产量,并与行为变化相一致。但他们使用的是神经生化方法,未能阐明二药的具体作用部位。本实验结果支持异氟醚、安氟醚麻醉抑制中枢NO-cGMP信息途径的观点。有研究证实脑内NOS主要位于脑皮质、脑干、小脑及边缘系统的上丘脑、下丘脑、海马、隔区和杏仁簇核。边缘系统在种系发生上是比较古老的,是调节内脏活动、神经内分泌、学习记忆和睡眠的中枢系统。边缘叶、与边缘叶皮质结构相似的区域,以及在功能和联系上较密切的一些皮质下结构包括在一起,称为边缘系统。视上核(Supraopticnucleus,SO)是丘脑下部最重要的核团之一,内有内分泌性神经元,除分泌加压素和催产素外,还分泌亮氨酸脑啡肽、强啡肽和β-内啡肽。有研究表明刺激视上核能明显提高疼痛阈值,使β-内啡肽和亮氨酸脑啡肽释放增加,因此认为视上核可能参与痛觉的调控。有报告通过脑薄片全细胞技术观察到安氟醚和异氟醚使视上核神经元放电频率明显增加。本实验结果显示:安氟醚组视上核NOS阳性神经元数量和平均灰度水平明显低于对照组(P<0.01)。异氟醚组视上核NOS阳性神经元数量有减少趋势,与对照组差别无统计学意义(P>0.05),但其平均灰度水平显著低于对照组(P<0.01),因此认为视上核NOS阳性神经元改变均参与了异氟醚、安氟醚诱导过程。结合以上结果认为,安氟醚和异氟醚兴奋视上核使内啡肽分泌增加,影响NOS阳性神经元,可能是安氟醚、异氟醚麻醉镇痛作用的重要机制。同时二药影响加压素和催产素的分泌,表现为临床麻醉诱导中的心血管系统的改变。下丘脑室旁核(Pa)是重要的调节心血管活动的较高级中枢。下丘脑室旁核存在NOS/NO系统,它通过非胆碱能非肾上腺能纤维下行投射影响各级交感神经中枢,还通过影响脑内神经递质和肽类的合成及释放,对心血管系统进行调节。本实验结果提示,异氟醚或安氟醚通过下丘脑室旁核中NOS阳性神经元改变而影响NOS/NO系统,调节心血管系统,这与吸入麻醉诱导期的心血管反应有关。杏仁核也是边缘系统的一个重要核团,刺激该核团可表现为情绪、呼吸、血压、心率和内分泌的改变和镇痛作用,这与麻醉诱导过程极为相似。徐礼鲜等研究报道,安氟醚、异氟醚吸入1h能诱导杏仁基外侧核、杏仁基内侧核的Fos阳性神经元明显增加,抑制中央杏仁核的自发放电活动。从本实验中观察到,杏仁基外侧核NOS阳性神经元数量和平均灰度水平降低。推测杏仁核参与了异氟醚、安氟醚麻醉过程,其作用机理部分与NOS阳性神经元的改变有关。隔核是许多纤维系统来往贯穿的区域,外侧隔核是主要接受传入纤维,内侧隔核发出传出纤维。隔核还参与视听觉传递过程,并由此起引情绪变化。伏隔核(Ab)是基底前脑的一个较大核