温敏性壳聚糖水凝胶材料的制备及细胞相容性研究

温敏性壳聚糖水凝胶材料的制备及细胞相容性研究

1壳聚糖水凝胶在心血管疾病治疗中的应用干预性心脏疾病的发病率和死亡率很高。临床上治疗晚期缺血性心脏疾病的主要方法是进行心脏移植,但该方法受到供体来源的限制。近年的研究表明,单纯细胞移植治疗虽可提高受损心脏功能,但在移植过程中细胞滞留率和存活率低,导致长期治疗效果不明显。组织工程学的诞生为缺血性心脏疾病的治疗带来了希望,尤其是近年可注射性水凝胶生物材料研制不断取得突破,为可注射性组织工程化心肌的研制及心脏疾病的治疗奠定了基础。可注射性水凝胶材料是携带细胞的载体,起着携带细胞、促进细胞体内移植区滞留及增殖与分化的作用,是可注射性组织工程化心肌研制的重要组成部分。以往用于治疗缺血性心脏疾病的可注射性材料主要包括纤维蛋白胶和Matrigel胶等,但这些材料在心梗部位移植后降解过快,影响了治疗效果。壳聚糖水凝胶是应用多元醇甘油磷酸钠中和壳聚糖溶液后得到的温敏性材料,它具有生物相容性好、体内降解时间及凝固时间可调节控制等优点,在软骨组织工程等领域已经得到应用。但对于这种材料的研制方法及与细胞粘附、支持生长等方面的研究较少。因此,我们对以氯化壳聚糖和β-甘油磷酸钠为原料制备的可注射的壳聚糖水凝胶,进行了系统的理化特性分析以及和C2C12细胞的粘附、支持作用等方面的研究,为可注射性心肌组织工程的研究提供可靠的实验数据。2材料和方法2.1材料表面2.1.1抗氧化酶siga氯化壳聚糖(Protasan-UP213,挪威,脱乙酰度86%,盐酸含量14%);β-甘油磷酸钠(Sigma,美国);胰蛋白酶(Sigma,美国);高糖DMEM培养基(Gibco,美国)(每升中含NaHCO33.7g,HEPES2.4g,青霉素、链霉素各10万单位);胎牛血清(MDgenicsInC,美国);其余常规试剂均为分析纯试剂。2.1.2克氏原螯虾4-5CO2孵箱(美国);旋转粘度计VISCOSTARPlus(西班牙);OLYMPUS显微镜及照相系统(日本);LEICA切片机(德国);LEICA倒置相差显微镜(德国);YJ-875型超净工作台(哈东联);PH211型pH计(意大利)。2.1.3细胞成像c1c12C2C12细胞由军事医学科学院基础医学研究所提供。2.2方法2.2.1em培养基氯化壳聚糖(C)0.2g紫外线照射灭菌,溶于10mlDMEM培养基中,配制为2%C-DMEM溶液,4℃冰箱备用。β-甘油磷酸钠(GP)4.5g溶解于10ml的DMEM培养基,配制为45%GP-DMEM溶液,0.22μm过滤除菌,4℃冰箱备用。2.2.2地壳聚糖溶液的ph值的测定用pH试纸分别测定4℃、室温和37℃时,2%C-DMEM溶液的pH值。2.2.3材料准备将2%C-DMEM溶液和45%GP-DMEM溶液以4:1的比例在冰盒上充分混合,然后置于37℃,15min后即变为固态凝胶。2.2.4溶液粘度测定使用VISCOSTARLCP型旋转粘度计,在0min、3min、7min3个时间点分别测定2%C-DMEM溶液的粘度,以及2%C-DMEM和45%GP-DMEM溶液以4:1的比例混匀后溶液的粘度。2.2.5添加其他gp-dmem溶液配制1%、2%、3%、4%、5%C-DMEM系列溶液,在上述系列溶液中分别按比例加入45%GP-DMEM溶液。充分混匀溶液后转移到10ml的离心管,37℃孵箱放置,每隔5min观察混合溶液的相转变行为,以离心管倒置时溶液不再流动判定是否成胶。2.2.6水凝胶的显微观察将配制好的壳聚糖水凝胶混合溶液置于24孔板中,37℃放置15min后变成固态水凝胶,然后在显微镜下观察。将材料进行冰冻切片,分别进行HE染色和Masson三色染色,观察其结构。2.2.7壳聚糖水凝胶对c2c12细胞的吸附能力将已经制备好的壳聚糖溶液以每孔300μl的量注入12孔板中,37℃交联作用15min,当混合液成为固态凝胶状铺于孔板底部时,每孔接种105个C2C12细胞,并加入培养液常规培养。1h后在显微镜下随机选择细胞均匀分布的5个视野进行细胞计数,评价壳聚糖水凝胶对C2C12细胞的吸附能力。而后每天在显微镜下观察C2C12细胞的形态变化和生长情况。3结果3.1壳聚糖水凝胶的制备在冰盒上混匀的液态凝胶为无色透明的液体,并且在室温条件下长时间保持液态,37℃时短时间内发生交联反应,变为固态胶冻样凝胶。3.2皮聚糖溶液的ph值4℃测定结果:2%C-DMEM溶液的pH值为6.9,在室温和37℃时pH值不发生变化,即壳聚糖溶液的pH值不随温度升高发生改变。3.3混合的浓度3.2%c-dmem和45%gp-dmem溶液b液室温下2%C-DMEM溶液(A液)的粘度为211.14CP;2%C-DMEM和45%GP-DMEM溶液(B液)以4:1的比例混合3min后,粘度增加。旋转器搅拌7min后,达到粘度计的最大测量值2000CP(见表1)。3.43成胶时间的确定37℃孵箱中,不同浓度的C-DMEM溶液与45%GP-DMEM溶液以4:1的比例充分混匀后,成胶时间不同,见表2。其中当C-DMEM溶液的浓度为2%时,成胶时间最短,为15min。3.5mahens型壳聚糖水凝胶大体观察为乳白色胶冻状,HE染色可见颗粒大小均匀的嗜红着色,颗粒与颗粒之间有红染着色的丝状相连,形成大小均一、形状不规则的网格样平面(见图1A);Masson三色染色为深浅不一的红色,中间嵌有许多空洞样圆圈(见图1B);未染色的材料在显微镜下观察,可见水凝胶质地均匀,表面为颗粒样或者为孔隙样物质(见图1C)。3.6圆形细胞的生长C2C12细胞在壳聚糖水凝胶表面复合1h后尚未伸展,可以观察到圆形细胞紧贴在材料表面(见图2A),而后可观察到细胞在壳聚糖水凝胶中生长状态良好;培养3d后细胞开始生长,培养5d后细胞基本铺满细胞培养皿底面(见图2B)。4壳聚糖水凝胶的作用及其机制心肌梗塞是心脏病死亡的主要原因,由于心梗发生后心肌不能再生,无收缩功能的纤维结缔组织会逐渐代替死亡的心肌,最终导致心功能衰竭。心肌梗死区局部移植治疗是心脏缺血性疾病的一种有前景的治疗方法之一,近年来取得了明显进展。各种来源的细胞,如心肌细胞、骨骼成肌细胞、内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞以及小鼠和人胚胎干细胞等均已经被用于心肌缺血疾病的移植治疗。研究表明,这些细胞可以减轻纤维结缔组织增生程度,促进新生血管生成,阻止心室壁进一步重构,从而改善心脏功能。但是细胞局部移植治疗的方法存在明显的限制性因素,如移植区细胞的低滞留率和低存活率等。因此,如何提高细胞携带能力以及局部注射后存活率是细胞移植治疗中的关键问题。为了提高细胞携带能力以及局部注射后细胞的存活率,通过可注射性生物材料携带细胞的方式,可为细胞运输和细胞心梗部位存活提供三维空间,材料发挥了细胞外基质功能,进而提高细胞的运输率及体内的存活率。但现在常用的纤维蛋白胶和Matrigel胶等材料均存在降解时间过快,细胞滞留率低等缺点。壳聚糖是一种天然生物多糖,可以和离子、聚合物以多种方式复合,形成温敏性凝胶或光敏性凝胶等。已有研究者将光敏壳聚糖水凝胶应用到心肌缺血的实验中,结果发现,壳聚糖水凝胶可以明显促进心肌细胞的存活、诱导新生血管生成、改善心脏功能。研究表明,温敏性壳聚糖水凝胶具有良好的组织相容性、对携带的药物、因子或细胞具有控制释放的作用。但对于温敏性壳聚糖水凝胶的各种理化性质的研究报道较少。因此,我们在这方面进行了较为系统的研究,我们选用的氯化壳聚糖的脱乙酰度为86%,通过对其溶解性和酸碱度的检测发现,氯化壳聚糖在DMEM溶液的溶解性良好,与正常细胞生长环境更加接近。通过测定37℃时凝胶作用的时间,我们进一步证实,2%的溶液比3%的溶液制备凝胶的时间要快10min,因此,我们选用2%的壳聚糖溶液和45%的β-甘油磷酸钠溶液制备的壳聚糖水凝胶进行后续实验。显微镜下观察制备的壳聚糖水凝胶,发现它由许多细小颗粒整齐地平铺而成,颗粒与颗粒之间有无数空隙。HE染色和Masson三色染色发