正常生活状态下大鼠脑内全脑内c

正常生活状态下大鼠脑内全脑内c

c-fos基因家族是c-fos、fos-b、fra-1和fra-2的立即早期基因。此家族的基因特别是c-fosmRNA及其表达产物FOS蛋白被用作神经元功能活动标记物已被广泛应用且日臻成熟。许多作者应用这一指标研究各种刺激诱导下的中枢神经元的功能活动状态,获得了大量有价值的资料。但是本文作者等的研究发现,在未给予任何特异性的实验性刺激时,脑内一些部位的神经元也有较强的恒定的FOS表达,这往往成为混淆实验结果分析的因素之一。全面了解在正常生活状态下的动物脑内FOS的基础表达,对了解与动物基础代谢和生理活动相关的核团以及正确分析各种实验结果有重要的意义。迄今尚未见对此做深入系统的报道,脑内哪些核团有较强的基础FOS表达还未见报道。因此,本研究用正常生活状态下的大鼠对此问题进行了系统研究,并以福尔马林试验作为对照。材料和方法1.小鼠脑损伤和大鼠脑总酸ld50雄性SD大鼠12只,体重180～250g,在温暖、自然光线、水和食物充足、相对安静并且可自由活动的环境中饲养一周。随机分为2组:无实验性刺激组6只,疼痛刺激组6只。每组动物分两笼饲养,每笼3只,以避免同笼动物数量过多,造成抓取动物时对其它动物的干扰。每天下午2～5h进行抓摸训练,以使动物适应给药时的抓摸刺激。取材时间为下午2～5h,同笼中3只动物在5min内先后麻醉。无刺激组在未给予任何实验性刺激的状态下,迅速给予1%戊巴比妥钠(80mg/kg)腹腔内注射,麻醉后开胸,经心脏灌注,先用生理盐水100ml冲净血液,然后用预冷的4%多聚甲醛固定液400ml灌注,先快灌200ml,继之慢灌200ml。待固定液滴注完毕,取脑,用4%多聚甲醛后固定2h,再将脑组织块放入含20%蔗糖磷缓液,4℃过夜。组织块完全沉底后用冰冻切片机连续冠状切片,每5张取一张,片厚50μm。疼痛刺激组在麻醉状态下向右上唇注射5%甲醛溶液50μl,存活2h后麻醉取材,余同无刺激组。2.tri顿x-100封闭先将切片经0.01mol/LPBS漂洗5min×3次后,浸入80%甲醇和0.3%过氧化氢封闭30min,0.01mol/LPBS漂洗10min×3次,再用1%牛血清白蛋白、3%羊血清和0.3%TritonX-100封闭1h。同前漂洗之后,用ABC方法进行免疫组化反应:首先将漂片浸入兔抗FOS抗体(1∶3000,SantaCruz),室温孵育36h;0.01mol/LPBS漂洗10min×3次;入生物素化的抗兔二抗,室温4h;0.01mol/LPBS漂洗10min×3次;最后入生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(ABC,1∶500,Sigma公司),室温2h,0.01mol/LPBS漂洗10min×3次。用硫酸镍铵DAB蓝色反应法进行呈色反应,当阳性产物呈深蓝色而背底几乎无色时终止反应,贴片,梯度脱水、透明、封片,光镜下观察。电生理检查fos阳性神经元的表达对无实验性刺激组从延髓尾端到端脑的全脑切片进行了观察。FOS样免疫反应阳性神经元出现在非常广泛的脑区,在所观察的6例动物中,FOS阳性细胞的分布模式都非常相似。其中4例较强,2例略弱。出现FOS阳性神经元的核团分为三种情况(Figs.1～6):(1)出现较多FOS阳性神经元的核团;如:孤束核的连合部和内侧部,脑桥核,下丘,丘脑的室旁核,下丘脑的乳头体上核、视交叉上核,中央杏仁核,新皮质等;(2)出现中等量FOS阳性神经元的核团,如:三叉神经脊束核尾侧亚核(三叉神经感觉核团其它亚核几无阳性反应),A1区、舌下神经前置核,中央灰质腹外侧部,下丘脑后区,外侧膝状体腹侧核,视上核,扣带回皮质,等;(3)出现少量FOS阳性神经元的核团,如:最后区,前庭内侧核,中缝苍白核,中缝大核,耳蜗背侧核,外侧丘系核,蓝斑,A5区,A7区,面神经膝上核,上丘,E-W核,丘脑板内核群,海马锥体层,下丘脑弓状核及背内侧核、室旁核杏仁内侧核,视前内侧区,嗅结节,终纹床核等(详细内容见附表)。在阳性细胞较少的两例,上述一、二类核团中都有阳性细胞,只是数量略少,而在第三种核团内则偶见。口周注射甲醛的疼痛刺激组与无实验性刺激组相比,在部分核团内的FOS表达出现特征性变化。如在实验侧三叉神经脊束核尾侧亚核的Ⅰ、Ⅱ层内FOS阳性神经元数量显著增多(Figs.7,8),而Ⅲ、Ⅳ层较正常动物减少。在下丘脑室旁核内侧小细胞部也出现大量的FOS阳性神经元。但疼痛刺激组的脑内大部分核团,标记细胞的数量和分布模式与正常无实验刺激组相比无明显变化。在丘脑腹后内侧核内也未发现FOS表达。动物脑区fos表达状态c-fos原癌基因是即刻早期基因中的一种,对神经递质、激素、神经冲动等外界刺激的传入信息在数分钟内即可迅速作出反应、进行表达。正常的原癌基因及其蛋白产物对细胞的生长、分化和功能活动至关重要。在包括神经元在内的绝大多数正常细胞中c-fos也有低水平的表达,其转录激活在5min内即可发生;FOS蛋白一般在刺激后20～30min即可检出,60～90min达高峰,可持续2～5h。当机体接受外界刺激时,c-fos和c-jun(即刻早期基因之一)被快速诱导转录,翻译出的FOS和JUN迅速进入核内,组成异源二聚体FOS-JUN复合物或同源二聚体JUN-JUN,与靶基因的调节区即蛋白激活子-1(AP-1)结合,诱导靶基因的基本转录和刺激后转录,从而把外界信号与基因表型的改变耦联起来。c-fos原癌基因是刺激激活神经元的第二信使与目的基因表达间的信息传递中介物,因此它又被称为神经元的一种“第三信使”。本研究发现,在未刺激组非常广泛的脑区有FOS表达。本研究从抓取和麻醉到固定液开始滴灌,均在数分钟内完成,而刺激诱导FOS表达的上调,需在20min以后,因而本实验发现的这些FOS表达不可能归因于麻醉过程所诱发,而与机体的基础代谢和日常活动相关。动物机体存在着昼夜节律,体内的激素水平发生着节律性的变化;机体不断地进行新陈代谢,也可导致激素和神经递质释放水平的改变;同时,动物总是不可避免地受到外界光线、声音及其它的刺激,个体之间也在不断发生着信息传递。所有这些,都可对动物构成刺激,激活第二信使,并进而导致c-fos基因的表达。因此,动物在未接受实验性刺激时,在其脑内与这些功能活动有关的核团FOS表达也应该是存在的,而且也应该是存在节律性改变。因而在本实验中,动物脑区存在着广泛的FOS表达是可以理解的。了解动物无实验性刺激状态下的脑内FOS表达状态,无疑地对在各种实验刺激条件下FOS表达结果的分析具有重要意义。在分析一些基础FOS表达较强的核团如孤束核、臂旁外侧核、下丘、丘脑室旁核、杏仁中央核等核团时尤应谨慎。如孤束核接受某种实验刺激之后仅发现FOS阳性细胞有轻度增加时,则不能把所有FOS阳性神经元都归诸于这种刺激的影响而不考虑基础表达的状态,否则必将导致错误的结论。因而,严格、谨慎地设置对照组及科学地进行统计学分析极其重要。同时,刺激强度和性质的改变,以及取材时间的不同也都可以影响第一信使物质的量,也可影响FOS的表达量。譬如同样的束缚与制动,有的报道在杏仁中央核中出现FOS改变,而有的报道则相反;海马齿状回的基础FOS表达高峰时间在20∶00h,而最低时间在12∶00h。除此之外,脑内其它核团也有相似的或相反的时间表达规律,对于这些因素在进行实验设计时都应予以考虑。也应考虑c-fos以外还存在其它“第三信使”,c-fos仅是百余种即刻早期基因中的一种。本实验结果提示,口周给予甲醛刺激后,有的核团出现特征性的FOS表达变化,而大部分核团则无明显变化。本文作者等在研究免疫激发的实验中,无论在实验组还是对照组,也在本文观察到的绝大多数核团内见到FOS表达。这一方面说明了FOS对于某些刺激或脑内某些核团的功能变化是一种很好的观察指标;另一方面提示对脑内大部分FOS表达未见明显的量的变化的核团,解释其结果时也需要谨慎。另外,FOS指标并非适合于任何刺激和脑内核团的功能学变化的观察,因为某些细胞(包括神经元在内)针对某些特异性刺激的功能活动的信使物质也可能是c-fos之外的其它“第三信使”。传统的生理学结果都表明丘脑腹后内侧核与伤害性刺激的传递有关,但给予疼痛刺激后此核却不出现FOS表达。因而,有时仅依赖单一即刻早期基因表达作为细胞活动的功能性指标则易误导结论,若辅以其他种类即刻早期基因,比如Egr-1、c-jun等,证据就可能更为可靠。本研究的结果提示,在进行利用FOS作标记物的实验中应注意:(1)在处死动物时,尽可能地选择在同一时间点内,避免昼夜节律等实验条件以外的状态对FOS表达产生的影响;(2)实验刺激的强度及性质应该相等,具有可比性,持续时间也应一致。FOS表达在60～90min达高峰,持续2～5h,因此应掌握好取材时间点;(3)动物在处死前的环境应尽可能排除实验因素以外的干扰,同时,应给予