nf1基因表达产物神经纤维素在正常成年大鼠脑中的分布

nf1基因表达产物神经纤维素在正常成年大鼠脑中的分布

nf1是一种常染色体遗传疾病，由神经细胞因异常程度而导致大部分身体系统损伤。发病率为1/（30003500）。此病的主要特点为外周神经多发性神经纤维瘤以及皮肤的咖啡色素斑。在NF1发病过程中,NF1基因的突变极为关键。NF1基因为一种肿瘤抑制基因,该基因定位于第17号染色体长臂1区1带2亚带(17q11.2),由其编码的蛋白质为神经纤维素(neurofibromin)。神经纤维素参与细胞的生长与分化,其氨基酸序列与哺乳类GTP酶活化蛋白(GTPaseactivatingprotein,GAP)家族相似,可加速GTP水解成GDP,从而将细胞原癌基因ras编码的蛋白质p21ras从活化型的三磷酸鸟苷(GTP)结合形式p21ras-GTP转化为失活型的二磷酸鸟苷(GDP)结合形式p21ras-GDP,使原癌基因ras活性下调,从而发挥抑癌作用。尽管有证据表明NF1基因作为肿瘤抑制基因在控制细胞的生长分化过程中起重要作用,但目前对神经纤维素的作用机制尚不很清楚。如拟研究神经纤维素的功能,必须首先搞清楚神经纤维素在脑组织的表达。目前,关于神经纤维素在成年动物脑组织分布的报道尚少且结果也不尽相同。本研究运用免疫荧光组化法对成年大鼠脑中神经纤维素的分布进行了观察,同时使用了兔抗神经纤维素血清和小鼠抗星形胶质细胞特异性酶—胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体等两种抗体作为一抗,以确定神经纤维素在星形胶质细胞是否表达。材料和方法1.zamheni溶液成年SD雄性大鼠5只,体重200～300g,用3%戊巴比妥钠(1ml/kg体重)腹腔内注射麻醉后经升主动脉灌注,固定。先用生理盐水50～100ml快速冲洗,后用Zamboni液(含2%多聚甲醛和15%苦味酸的0.1mol/L磷酸缓冲液,pH7.4)约200ml灌注50min。取脑修块,置相同固定液中4℃后固定25h,然后将脑块浸于含20%蔗糖的0.0lmol/LPB(pH7.4,4℃)中至沉底。恒冷箱冠状连续切片,片厚30μm,每隔-片取1片。2.免疫荧光观察切片经0.0lmol/LPBS(pH7.4)漂洗5min×3次,0.3%TritonX-100处理1h(37℃),再用10%正常山羊血清孵育1h(37℃)。同前漂洗后,用间接法进行免疫荧光反应:(1)在含兔抗神经纤维素血清(NF1GRP,1∶80,SantaCruz)和小鼠抗GFAP单克隆抗体(1∶1200,Chemicon)的稀释液中孵育2h(37℃);(2)用PBS洗2次,每次5min;(3)在含有FITC标记的山羊抗兔IgG(1∶200,SantaCruz)和rhodamine标记的山羊抗小鼠IgG(1∶200,SantaCruz)稀释液中孵育4h(室温);(4)切片用PBS清洗后,裱片,干燥后用缓冲甘油封片,荧光显微镜(NikonUFX-Ⅱ)观察,照相。替代实验用1∶10正常山羊血清代替一抗,其余步骤同实验组,实验结果为阴性。神经纤维素阳性细胞神经纤维素阳性细胞在4号滤色片(波长为490nm)下发绿色荧光;GFAP反应阳性细胞在3号滤色片(波长为550nm)下呈红色荧光。本实验观察到神经纤维素在端脑、间脑、脑干和小脑中都有广泛分布(表1,Fig.1),荧光标记物分布在神经细胞的核周质及胞核中,在部分较大的细胞还能见到其突起中也有绿色荧光标记物分布。在4号滤色片下观察时,可见在大脑皮质中神经纤维素阳性细胞最为密集(Figs.2,3)。海马结构CA1～CA3区、齿状回、丘脑前核群、丘脑内侧核群(Fig.4)、丘脑板内核群、丘脑中线核群及下丘脑室周核、室旁核等处的神经纤维素阳性细胞也比较密集。杏仁核(Fig.5)、视交叉上核、视上核、乳头体上核、顶盖前区、下丘脑前区、下丘脑外侧区、下丘脑后区以及小脑的Purkinje细胞层、颗粒层等部位也有数量较多的神经纤维素阳性标记细胞。此外,尾壳核、屏状核、苍白球、缰内侧核、缰外侧核、外膝状体核、内膝状体核、隔外侧核(Fig.6)、隔内侧核、隔下丘脑核以及下丘脑外侧前核、下丘脑背侧核(Fig.7)、顶盖前区(Fig.8)、三叉神经脊束核、蜗神经背核(Fig.9)、蜗神经腹核、前庭上核、前庭内侧核(Fig.10)、前庭外侧核、巨细胞网状核等部位也有数量不等的神经纤维素阳性细胞分布。在4号滤色片下观察到的神经纤维素阳性细胞由于其所在脑区的不同,其胞体大小及形态也有所不同。小细胞未能观察到突起,大细胞突起也较少,荧光标记物质在胞浆、胞核及突起中均有分布(Figs.2～11)。转换3号滤色片观察时,可见除大脑皮质中GFAP阳性标记细胞较少外,其余各脑区和核团都有大量的GFAP阳性标记细胞分布,胞体相对较小,并由胞体发出许多突起,胞体及突起均呈红色荧光(Fig.12)。这些GFAP阳性标记细胞均可确认为星形胶质细胞。在同一视野分别用3号、4号滤色片观察、照像,对比神经纤维素阳性细胞和GFAP阳性细胞的位置,结果未发现处于相同位置的双标记细胞(Figs.11～13)。神经纤维素在细胞中的表达关于NF1基因表达产物神经纤维素在脑内的分布,Gutmann通过Western及Northern印迹实验发现神经纤维素在培养的小鼠神经细胞及星形胶质细胞中均有表达。Daston等通过免疫组化方法,发现神经纤维素在人及大鼠脊髓的神经细胞、Schwann细胞及少突胶质细胞中有表达,在星形胶质细胞中则无表达。在成年大鼠脑内神经纤维素的分布状况,则目前尚未见报道。本实验用免疫荧光组化法证明了神经纤维素在大鼠脑中的分布是非常广泛的。除大脑皮质中可见大量的阳性细胞外,在杏仁核、海马结构、丘脑前核群、丘脑内侧核群、丘脑板内核群、丘脑中线核群及下丘脑室周核、下丘脑室旁核、下丘脑前区、下丘脑外侧区、下丘脑后区、隔外侧核、隔内侧核以及尾壳核、屏状核、苍白球、三叉神经脊束核等部位也都观察到数量不等的阳性细胞分布。以往报道神经纤维素仅存在于胞质内,但本研究观察到除胞质外,细胞核也含有丰富的神经纤维素阳性反应产物。神经纤维素是否存在于神经胶质细胞?如上所述Gutmann用Western及Northern印迹法在培养的小鼠星形胶质细胞中检测出有神经纤维素表达,神经纤维素存在于星形胶质细胞的细胞质中。但Daston等用免疫组化法在人和大鼠脊髓的星形胶质细胞却未观察到神经纤维素阳性反应产物。本研究重点观察了大鼠脑内星形胶质细胞,用含抗神经纤维素和抗星形胶质细胞标志酶-GFAP的抗体混合液孵育切片,此结果仅见到GFAP阳性的星形胶质细胞,而未见到双标记的星形胶质细胞,此结果与Daston等的报道一致,而与Gutmann的结果不同。这种差异表明,在正常生理条件下,神经纤维素可能主要在神经元中表达,而在星形胶质细胞中无表达或很少表达。由于神经纤维素在星形胶质细胞中的含量较少,因此用免疫组化方法检测不到反应信号,而可被Western和Northern印迹法检出。此外,有资料表明,在培养细胞中,神经纤维素的表达水平可能升高。关于神经纤维素的功能,Gutmann根据在正常生理条件下,星形胶质细胞中神经纤维素的表达水平较低,而在病理条件下,星形细胞瘤的星形胶质细胞中神经纤维素的表达水平升高;在NF1+/-小鼠(NF1靶基因变异杂合体小鼠),由于NF1基因突变,星形胶质细胞中神经纤维素含量降低,表现为星形胶质细胞数量增加等现象,推测神经纤维素可能是作为生长调节因子在星形胶质细胞的生长过程中起重要的调节作用。尽管神经纤维素在神经元中有大量的表达,但是它在神经细胞具有什么功能,作用机制如何,目前研究尚不多。有研究认为神经纤维素参与了信号通道的组成,并具