gnih在公猪生殖发育中的定位及发育学变化

gnih在公猪生殖发育中的定位及发育学变化

促性腺激素激素（gnih）是对日本三尖巢动物的大脑中首次发现的一种神经知识分子。GnIH为十二肽(SIKPSAYLPLRF),能直接作用于垂体,抑制促性腺激素的释放。现已发现在鸟、啮齿动物、羊、牛、猴和人类的脑内均有GnIH分布,与促性腺激素释放激素(GnRH)一起成为动物生殖调控中关键的神经内分泌因子。猪的GnIH主要存在于脑部,并且表达模式与其受体GPR147的基本一致。有研究表明:GnIH神经元分布于鹌鹑的下丘脑室旁核,GPR147存在于日本鹌鹑的下丘脑和垂体中。GnIH和其受体GPR147分布于叙利亚仓鼠和鸟的睾丸中。GnIH通过GnRH系统和垂体前叶的GnIH受体GPR147实现其功能。GnIH除了生殖调控作用外,还具有促进动物摄食和影响动物行为等多种生理功能。GnIH的发现开辟了动物生殖内分泌调控的新视野。关于GnIH及其受体的基因克隆、分布定位和生理功能的研究已见大量报道,但是已研究的物种仍然较少,研究内容尚不深入,GnIH的作用机制及生理功能研究尚不全面。笔者所在实验室已经研究了GnIH及其受体在调节母猪生殖活动中的潜在作用。因此,本试验主要研究GnIH在小梅山公猪下丘脑-垂体-睾丸(HPT)轴的分布和发育学变化,为全面了解GnIH的功能提供试验和理论依据。1材料和方法1.1公猪及猪厂3、30、60、90和120日龄健康小梅山公猪各3头(分组参照徐永杰等研究报道),购自江苏省句容农博园种猪厂。试验期间所有试验仔猪均按常规方法饲养,自由饮水和采食。1.2试剂和试剂盒Trizol试剂、反转录酶(M-MLV)、RNA酶抑制剂、dNTPs、寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸(OligodT18)、rTaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司;焦碳酸二乙酯(DEPC)和琼脂糖购自南京生兴生物技术有限公司;DNAmarker(DL2000)、DNA胶回收试剂盒(Axygen)购自南京博全生物技术有限公司;一抗为豚鼠抗人NeuropeptideVF(NPVF,C7orf9,NeuropeptideRFRP-3,RFRP-3,GnIH),货号:N2176-47,Biological,USA;即用型SABC免疫组化染色试剂盒(羊抗豚鼠)购自北京博奥森生物工程有限公司;其他试剂均为国产分析纯。GnIH和GAPDH引物由上海英骏生物技术有限公司合成。1.3免疫组化染色1)动物经颈总动脉放血致死,立即取其一半下丘脑(另一半用于研究mRNA水平发育学变化)、垂体和睾丸,放入4%(体积分数)多聚甲醛溶液中固定12~24h。2)固定后下丘脑样品用0.1mol·L-1PBS充分洗涤,放入用0.1mol·L-1PBS配制的200g·L-1蔗糖溶液,4℃条件下待样品下沉后做冰冻切片。下丘脑切片厚20μm,垂体切片厚8μm,卵巢切片厚10μm,贴裱于经多聚赖氨酸处理过的载玻片,室温干燥后置于-20℃保存。所有样品切片分2套,其中一套用于免疫组化染色,另一套用于空白对照。3)固定好的垂体、睾丸组织块用梯度乙醇脱水、石蜡包埋,然后进行常规石蜡切片。石蜡切片厚度为4μm,贴于多聚赖氨酸包被的载玻片上,烤片后于室温备用。4)免疫组织化学染色参照免疫组织化学说明书进行。一抗(1∶400)4℃孵育过夜,二抗37℃孵育1h。空白对照切片用0.1mol·L-1PBS代替一抗,其余步骤不变。用中性树胶封片剂封片。切片置于显微镜下观察拍照。1.4r-pcr反应1.4.1总rna的提取试验动物经颈动脉放血处死,立刻取其下丘脑组织,迅速投入液氮冷冻,然后转入-70℃冻存。按照Trizol试剂说明书在无RNA酶的环境下进行总RNA的提取。用紫外分光光度计测定总RNA浓度和纯度。将所提RNA稀释为1μg·μL-1,分装后于-70℃保存备用。1.4.2u-rna表达体系RNA反转录(RT)在无RNA酶的环境下按两步法进行。取总RNA2μg,按M-MLV反转录试剂盒说明书反转录获得样品RNA的cDNA。RT反应体系为25μL,包括2μg总RNA、0.4μmol·L-1OligodT18引物、0.4mmol·L-1dNTP。加入ddH2O至10μL,70℃变性5min,立即放冰上冷却,再加5μL5×RTBuffer、12URNA酶抑制剂、100UM-MLV,混匀后置入42℃水浴60min,72℃水浴10min。反转录产物分装后于-20℃保存备用。RNA反转录过程中同时以不加反转录酶的反转录体系为阴性对照。1.4.3系统中心肌注射和kodakid凝胶法检测codk-l-1的表达用半定量RT-PCR方法,以GAPDH为内源性参照基因,检测GnIHmRNA在不同日龄小梅山公猪下丘脑组织的表达水平。GnIH和GAPDH的引物序列和反应条件见表1。PCR程序:94℃5min;94℃变性30s,适当的退火温度(GnIH49℃,GAPDH57℃)退火30s,72℃延伸30s,适当循环(GnIH40圈,GAPDH35圈);最后72℃延伸10min。取10μL产物在20g·L-1琼脂糖凝胶上电泳,GoldenView染色。用KodakID凝胶图像分析系统分析条带灰度。根据目的基因GnIH和内参GAPDH的PCR产物的灰度比,确定样品中目的基因GnIH表达的相对含量。1.5数据统计分析数据结果均以平均数±标准误(ue0af±SE)表示,数据用SPSS17.0软件统计,差异显著性用独立样本t检验和单因子方差分析(one-wayANOVA,LSD),不同组间两两比较用LSD法确定差异显著性。2结果与分析2.1gnih阳性神经元/肌肉神经系统/水精学一般情况免疫组化结果显示:GnIH免疫阳性细胞呈棕褐色,在小梅山公猪下丘脑、垂体和睾丸均有分布。在下丘脑主要分布于室旁核(图1-A),GnIH阳性神经元呈纺锤形和多角形。在垂体分布非常广泛,无论是腺垂体还是神经垂体均有强烈的免疫阳性反应(图1-B)。在睾丸集中分布于生精小管内部(精原细胞和精母细胞),可见强烈的免疫阳性反应,在间质细胞也可见免疫阳性反应(图1-C)。对照切片呈阴性(图1-D、E、F),未见GnIH免疫阳性细胞。2.2pcr扩增gna使用特异性引物对提取的总RNA进行半定量RT-PCR,扩增小梅山公猪GnIHcDNA序列片段,经测序确定为目的片段。以15头小梅山公猪下丘脑cDNA为模板,扩增GnIH和GAPDH基因,经琼脂糖凝胶电泳进行分析(图2)。从图2可见:5个日龄组GnIH的表达呈现波动性变化,3d组GnIHmRNA的相对含量最高,30d降低,60d又升高,随后逐渐降低,120d组的最低(P<0.05)。2.3日龄不同日龄小发酵猪血清gnih阳性神经元的数目和形态变化免疫组化结果显示:GnIH免疫阳性细胞呈棕褐色,主要分布于下丘脑室旁核,胞体多呈纺锤形和多角形。不同日龄小梅山公猪下丘脑室旁核GnIH阳性神经元的数目和形态均随日龄不同呈现相应变化。随着日龄的增加,GnIH阳性神经元的数目呈波动性变化,胞体增大,形态更加清晰,且多趋向于多角形。对照切片呈阴性,未见GnIH免疫阳性细胞(图3)。3小agnih在生殖调控中的作用越来越多的证据表明,GnIH在调控许多哺乳动物的生殖功能方面起重要作用。先前的研究已经表明,GnIH及其同系物存在于脊椎动物并对促性腺激素分泌的调节起重要作用。Tsutsui等发现GnIH通过GnIH受体直接作用于脑垂体,抑制促性腺激素的合成和释放。在鹌鹑和鸡的体内、体外研究均发现GnIH通过垂体抑制促黄体生成素(LH)和垂体分泌卵泡刺激素(FSH)的合成,表明垂体内的GnIH扮演双重角色:首先降低促性腺激素释放到血液循环,随后抑制LH和FSH的合成。GnIH和GnIH-R都在睾丸生殖细胞中表达,揭示GnIH可能参与生殖细胞分化的调节。而且,GnIH可能存在自分泌或旁分泌,进而在HPG轴不同水平影响性激素的分泌。Li等的研究已经证实,GnIH/GPR147系统存在于母猪的生殖轴,在其生殖调控中可能扮演重要角色,在其他脊椎动物也存在类似的功能。在胎儿期和性成熟之间,睾丸间质细胞显示2个发育和活动阶段:围产期和产后13周。在发育过程中,GnIH的系统性变化表明在性成熟过程中GnIH扮演重要的角色。在本研究中,笔者发现GnIH在小梅山公猪下丘脑、垂体和睾丸均有分布,表明GnIH对小梅山公猪的生殖调控起重要作用。Zhao等发现GnIH主要是分布于叙利亚仓鼠的睾丸间质细胞、精原细胞和精母细胞,这与笔者的研究结果一致。然而,GnIH对小梅山公猪睾丸功能的影响需要进一步研究。本研究发现,在小梅山公猪下丘脑,GnIH在mRNA水平上呈波动变化。在产后3d的GnIH相对表达量最高,到30d降低,在60d又升高,随后逐渐降低。据文献报道,雄性小梅山公猪的爬跨行为第一次大约出现在(78.6±4.2)日龄,这表明GnIH可能对性行为起着重要作用。与3日龄表达量相比较,120d的表达量最低(P<0.05)。在笔者未发表的研究结果中,小梅山公猪睾丸组织在90d生精小管管腔明显增大,120d开始形成成熟精子。所以,GnIH可能参与生精作用的调控。Iwasa等研究了鼠下丘脑GnIH在mRNA水平上的发育学变化,发现大鼠下丘脑GnIH的表达随年龄增加发生显著变化,这与本研究结果一致。在本研究中,笔者发现GnIH阳性神经元存在于小梅山公猪下丘脑室旁核,并且随着年龄的增长,免疫阳性神经元逐渐变大,染色逐渐加深,数量呈波动性变化且与GnIHmRNA水平表达模式一致。此过程大致分为两个阶段:一是出生后至30d,GnIH免疫阳性神经元染色较浅,形态多呈圆形或梭形;二是从60d开始,GnIH免疫阳性神经元数目逐渐减少,胞体逐渐变大,突起的延伸范围变大,染色加深。突起增多表明它与相邻神经元的联系进一步复杂化。由此可见,从出生开始,小梅山公猪下丘脑室旁核内的神经