迷走神经对大鼠肛温和cfos表达的影响

迷走神经对大鼠肛温和cfos表达的影响

外源微生物感染后，免疫信息迅速通过抗原刺激释放，并自发地产生免疫反应。同时，将免疫信息传输到中枢神经系统，并在中枢神经系统中产生一系列反应。一般认为,免疫刺激影响脑的信息物质是细胞因子,细胞因子分子量大,难以通过血脑屏障。细胞因子将免疫信息传递到脑的途径是近几年研究的热点,现认为可能有以下几种途径,第一,当血液中细胞因子浓度增高时,其能通过脑血管内皮细胞上载体介导的可饱和的运输方式通过血脑屏障;第二,血液中的细胞因子可以通过缺乏血脑屏障的室周器官(CVOs)进入脑。第三,细胞因子可以诱导次级介质的产生,例如前列腺素,将免疫信息传递到脑。第四,细胞因子作用于脑血管内皮细胞使其表达粘附分子,并使其通透性增高,而使细胞因子进入脑。另外,近年研究发现迷走神经在免疫信息向脑传递过程中有作用,并进行了初步研究。c-Fos是一种原癌基因,它作为一种有效的反映神经元对外界伤害刺激发生反应的标志而广泛应用于显示对各种伤害性刺激引起反应的不同中枢部位。本文检测了膈下迷走神经切断对LPS腹腔注射后所引起的大鼠发热及孤束核(NTS)、下丘脑室旁核(PVN)c-Fos蛋白表达的影响,旨在探讨迷走神经在外周LPS信息传递入脑过程中的作用。1假手术方法1.1主要试剂LPS购自Sigma公司,来自大肠杆菌血清型055∶B5,批号122H4025。c-Fos抗体购自迈新公司,为兔多克隆抗体,目录号RAB-0187。S-P试剂盒购自迈新公司,批号91013970。1.2实验动物及分组Wistar大鼠,雄性,体重250~300g,由白求恩医科大学实验动物部提供。随机分组,以迷走神经切断并给予LPS组为实验组,相应设3个对照组,包括假手术生理盐水组迷走神经切断生理盐水组,假手术LPS组。迷走神经切断的实验方法为:用戊巴比妥钠(50mg/kg)将大鼠麻醉后,在上腹部剪开皮肤及腹膜,切断迷走神经在膈下的腹干和背干,并进行幽门成形术。假手术的方法为:麻醉后切开上腹部皮肤及腹膜,然后缝合。各组分别于手术后14d给予LPS0.5ml(25μg/kg)或生理盐水腹腔注射,测定动物体温,然后各组分别给予LPS后1h进行麻醉后左心室灌注4%多聚甲醛固定,取脑组织进行免疫组织化学染色,室旁核在耳间线前方6.4~7.0cm,孤束核在耳间线后方11.4~12.4cm。1.3动物体温测量动物于上午8~12点测定体温,方法是将大鼠置于特制固定架上,用ST-1数字体温计测定,将体温探头经肛门插入直肠内6cm,并固定于尾跟部,待动物体温基本稳定后测定体温,然后于给药后60min和80min再次测定体温,以60min和80min时体温的值减去基础体温为体温变化值(ΔT)。1.4免疫组织化学方法检测c-Fos蛋白的表达固定后的脑组织常规进行梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片,载玻片上涂多聚赖氨酸以防止脱片。石蜡切片经二甲苯、梯度酒精脱蜡入水,用S-P试剂盒进行染色。用3%H2O2(A液)室温孵育10min,以消除内源性过氧化物酶活性,用胰酶进行抗原修复,PBS(0.01mol/L,pH7.4)洗5min×3次,用正常兔血清(B液)室温封闭切片10min,甩掉封闭液,加上兔抗c-Fos抗体,4℃孵育过夜,PBS冲洗5min×3次,加生物素标记的二抗(C液),室温孵育30min,PBS洗5min×3次,滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液(D液),室温孵育30min,DAB显色,用Mayer苏木精复染核,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。每次染色均设有PBS代替一抗的阴性对照。在PVN计数200个细胞,计算阳性细胞百分数。在NTS计数100个细胞,计算阳性细胞百分数。1.5统计学分析实验结果以x¯±sx¯±s表示,用t检验进行组间比较。2结果2.1两组大鼠前口温变化值比较如表1所示,膈下迷走神经切断后明显地抑制了LPS所致的大鼠发热,给LPS后60min和80min时,实验组大鼠肛温变化值与假手术LPS组相比明显降低,两时间点两组分别相比有明显差异,P<0.05;与膈下迷走神经切断对照相比明显增高,P<0.05。假手术LPS组大鼠肛温变化值与假手术对照组相比明显增高,在60min和80min两时间点相比两组有极显著差异P<0.01。迷走神经对照组大鼠肛温的变化值与假手术对照组相比无明显差异,P>0.05。2.2两组c-fos表达情况c-Fos免疫组织化学染色法观察到,在NTS中c-Fos染色阳性细胞除了细胞核呈棕黄色之外,细胞浆也呈棕黄色。实验组c-Fos阳性细胞百分率为6%,假手术LPS组为67.2%,两组比较有显著差异,P<0.01;膈下迷走神经切断生理盐水组为0.5%,与实验组相比有极显著差异,P<0.01。假手术生理盐水组c-Fos阳性细胞百分率为0.5%,与假手术LPS组相比有明显差异,P<0.01。膈下迷走神经切断生理盐水组c-Fos阳性细胞百分率与假手术生理盐水组相比无明显差异,P>0.05,见图1和图2。2.3组患者c-fos表达情况c-Fos免疫组织化学染色法观察到PVN中c-Fos染色阳性细胞为细胞核呈棕黄色。实验组c-Fos阳性细胞百分率为23.5%,假手术LPS组为43.7%,两组比较有显著差异,P<0.01,膈下迷走神经切断生理盐水组为0.75%,与实验组相比有极显著差异P<0.01。假手术生理盐水组c-Fos阳性细胞百分率为0.5%,与假手术LPS组相比有明显差异,P<0.01。膈下迷走神经切断生理盐水组c-Fos阳性细胞百分率与假手术生理盐水组相比无明显差异,P>0.05,见图3和图4。3精神世界的意义本实验观察到LPS腹腔注射引起发热的同时,迷走神经感觉传入神经到达的核团NTSc-Fos阳性细胞百分率明显增高,PVNc-Fos阳性细胞百分率亦明显增高,表明外周给入LPS使迷走感觉传入神经活动,从而使其传入纤维到达的核团——NTS神经元呈现活动状态。有作者通过解剖学研究观察到,从NTS发出纤维有部分投射到PVN。因此推测NTS神经元活动会影响PVN神经元活动。本文发现发热的同时NTS和PVN活动神经元均增多,提示NTS神经元的活动有可能会引起PVN神经元的活动。我们进一步用膈下迷走神经切断动物模型来探讨这个问题。实验发现,膈下迷走神经切断后,动物发热明显降低,NTSc-Fos阳性神经元百分率降低10倍,而PVNc-Fos阳性神经元百分率降低了0.