耐力训练及补救性多糖对大鼠血清il-1和pbmc培养后血清il-1、下丘脑室旁核il-1r表达的影响

耐力训练及补救性多糖对大鼠血清il-1和pbmc培养后血清il-1、下丘脑室旁核il-1r表达的影响

长期高强度训练增加了运动员呼吸道感染的风险，这与运动员的免疫功能下降有关。神经内分泌系统具有重要的免疫调节功能,下丘脑室旁核(PVN)是下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴活动的直接控制部位,下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴激活引起的外周效应为糖皮质类固醇(主要为皮质醇)分泌增加,这是机体主要的应激反应体系之一,高浓度的糖皮质激素可选择性抑制细胞免疫功能。运动可诱发机体多种细胞因子发生变化,许多细胞因子有激活HPA轴活动的作用,IL-1、IL-6等对HPA轴有强兴奋作用。本研究采用流动水池建立大鼠递增负荷游泳训练模型,观察6周耐力训练后大鼠血清和外周血单核细胞(PBMC)培养后上清液IL-1β含量变化、下丘脑室旁核IL-1R表达和血清皮质酮含量的变化,探讨IL-1及其受体与HPA轴活化的可能关系和意义,同时选用牛膝多糖和黄芪多糖进行干预,为改善耐力训练引起的免疫低下寻找干预措施。1材料和方法1.1大鼠的筛选6周龄、体重110~130g的SPF/VAF级雄性Wistar大鼠48只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司,质量合格证号0043356),在清洁级动物房常规饲养近1周后,通过游泳能力筛检筛选出40只大鼠,按体重随机分为安静对照组、耐力训练组、训练+黄芪多糖组、训练+牛膝多糖组4组,每组10只。清洁级动物房室内温度为20℃~26℃,湿度50%~70%,昼夜节律用日光灯控制,每日光照时间12小时(早8点~晚8点),大鼠分笼饲养,每笼最多5只,自由进食和饮水。1.2灌胃1次大型半干2次黄芪多糖(APS)提取物(购自浙江霍夫曼德公司)和牛膝多糖(APBS)提取物(购自上海实久科技有限公司)用双蒸水配制。从正式实验开始,每日上午训练开始前60分钟对大鼠进行灌胃1次。训练+黄芪多糖组按2g·kg-1剂量(相当于黄芪多糖1g·kg-1)灌服黄芪多糖提取物,训练+牛膝多糖组按1g·kg-1剂量(相当于牛膝多糖0.7·kg-1)灌服牛膝多糖提取物,安静对照组和耐力训练组灌服等量安慰剂(双蒸水)。1.3水流量4.2安静对照组不运动,其他3组在流动游泳水池中进行训练。水深50~60cm(约为大鼠体长的1.5~2倍),水温32±2℃,水流量4m3/h。每天上、下午各训练1次,每周训练5天,共6周,训练时间由40min/d逐渐增加到160min/d,具体训练方案见表1。1.4血管腹主动脉采血大鼠脑il-1r最后一次训练结束36小时后取材。采用25%乌拉坦按0.5ml·100g-1体重的剂量进行腹腔麻醉,真空肝素锂抗凝采血管腹主动脉取血,用于外周血单个核细胞(PBMC)的分离与培养,带分离胶全血真空管制备血清后放于-80℃低温冰箱,用于测定IL-1β、睾酮、皮质醇。酒精消毒腹部后剖开腹腔,行左心室至主动脉插管,经4%多聚甲醛约150ml灌注固定后,取出脑组织,每组取3只大鼠脑组织测定下丘脑IL-1R。因测试试剂和采血量限制,部分指标测试样本数有所减少。1.5测试指标和方法1.5.1试剂盒的制备采用ELISA方法测定血清IL-1β,试剂盒为美国Biosource公司产品。采用放射免疫分析法测定血清睾酮和皮质酮,试剂盒均为美国DSL公司产品。1.5.2细胞培养浓度调整在超净台上按无菌操作分离PBMC细胞。分离方法及其无菌细胞悬液的制备方法见文献,最后用RPMI1640将细胞悬液浓度调整到2×106个细胞/ml。在24孔板上每个样品设2孔,每孔加细胞悬液1ml,加入有丝分裂原ConA(终浓度为5μg/ml),将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养36小时后收获培养上清液,2000r/min离心10分钟,上清移出置-80℃冻存,用ELISA方法测定上清液IL-1β(试剂盒为美国Biosource公司产品)。1.5.3免疫组化染色取脑组织放入30%蔗糖溶液浸泡,4℃过夜。经干冰-正己烷(-70℃)骤冷,参照大鼠脑图谱进行下丘脑室旁核定位,做额状面连续切片(20μm),将4张切片裱于同一张玻片上。脑组织Nissl染色:Nissl染液20分钟,蒸馏水洗,50%酒精分色,无水乙醇脱水,二甲苯透明,树胶封固。脑组织免疫化学染色:冷冻切片经冷风吹干后,用PV-6001/6002二步法显示下丘脑室旁核IL-1R。加入3%H2O2孵育10分钟,阻断内源性过氧化氢酶;加入兔抗鼠多克隆抗体(1:100),37℃放置1h,4℃冰箱过夜,第2日取出,室温放置1h,用0.01MPBS冲洗;滴加羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体(1:100),37℃,1h,用0.01MPBS冲洗;加入DAB复合物显色5~10分种,用0.01MPBS冲洗,蒸馏水终止反应;50%、70%、80%、95%酒精脱水各5分钟,100%酒精脱水5分钟2次,二甲苯透明,树胶封固。光密度测定:免疫组织化学染色后,每组取3只动物,每只动物取2~3张片子,每张片子随机取3个视野,在相同的光学和光源条件下,采用Leica公司Q550CW图像分析系统采集图像和Qwin图像分析软件分析测定观察部位的平均光密度值(AOD)。1.6方差及不同大小的anva使用SPSSforWindows11.0统计分析软件完成,用One-WayANOVA进行方差分析,方差齐次性时,采用LSD法进行多组之间比较;方差不齐次性时,用Tamhane’sT2法复选项进行多组之间比较。统计数值用mean±SD表示,显著性差异水平α=0.05。2结果2.1pbmc对大鼠il-1的影响表2显示,耐力训练组血清IL-1β含量最高,与安静对照组相比有显著性差异(P<0.01)。2个补充组大鼠血清IL-1β显著低于耐力训练组(P<0.05),而与安静对照组水平接近(P>0.05)。耐力训练组大鼠PBMC培养后上清液IL-1β含量最高,与安静对照组相比有显著性差异(P<0.01)。2个补充组PBMC生成IL-1β能力高于安静对照组(分别高26.1%、21.3%),低于耐力训练组(分别低10.2%、13.6%),但均无统计学意义。2.2大鼠脏器旁核il-1r表达水平由表3可见,耐力训练组大鼠下丘脑室旁核IL-1R表达最高,与安静对照组相比有显著性差异(P<0.05)。补充牛膝多糖组大鼠下丘脑室旁核IL-1R表达与安静对照组相同,显著低于耐力训练组(P<0.01)。补充黄芪多糖组高于安静对照组,略低于耐力训练组,但均无统计学意义。2.3皮质酮与强力训练组p>0.1表4显示,耐力训练组大鼠血清皮质酮含量最高,与安静对照组相比有显著性差异(P<0.05)。补充牛膝多糖组血清皮质酮与安静对照组相同,但显著低于耐力训练组(P<0.01);补充黄芪多糖组血清皮质酮低于耐力训练组(低17.3%),高于安静对照组(高26.5%)。耐力训练组大鼠血清总睾酮最低,与安静对照组相比有显著性差异(P<0.05)。2个补充多糖组血清总睾酮分别高于耐力训练组54.3%和54.4%,低于安静对照组21.4%和21.2%。3运动与血液相关指标的变化目前,关于高强度、长期运动影响机体免疫功能的确切机制尚不清楚。高强度、长期运动训练是一种刺激,会引起机体的应激反应,机体出现的应激反应首先涉及中枢神经系统机能,继而出现内分泌和免疫系统机能的改变。研究发现,细胞因子不但是重要的免疫调节因子,而且具有广泛的中枢调节作用。从细胞因子-神经-内分泌调节角度探讨训练对免疫功能的影响已经引起一些学者的关注。我们以前的研究发现,6周耐力训练可引起大鼠T细胞数量和功能变化,主要表现为活化的T淋巴细胞数量下降、T细胞亚群中CD4+细胞数量下降及CD4+/CD8+比值下降、T淋巴细胞增殖转化能力降低等,这些变化提示6周的耐力训练可引起大鼠细胞免疫功能下降。研究显示运动训练能引起体液中细胞因子的改变。一次运动或长期训练均可使血浆或血清IL-1水平或单核/巨噬细胞产生IL-1的能力显著提高。有学者提出,长时间剧烈运动时,由于内脏器官与运动器官之间血液重新分配,机体高代谢反应以及其它未确定的原因,肠腔内革兰氏阴性菌的胞壁成份LPS穿过肠粘膜屏障移位进入血液,运动者会出现类内毒素血症反应。LPS进入血液后可以刺激单核-巨噬细胞合成与分泌IL-1等细胞因子,推测这是运动后血浆IL-1等细胞因子浓度增加的一个主要原因。同时IL-1被认为是运动应激刺激释放的首批细胞因子之一,被分类为促炎性细胞因子,通过与相应高亲和力受体IL-1R结合发挥作用,有致热和介导炎症的作用,与机体免疫反应有密切关系。本研究结果显示,6周耐力训练能引起大鼠血清IL-1β含量和PBMC生成IL-1β的能力提高,而训练同时补充黄芪多糖提取物或牛膝多糖提取物可防止血清中IL-1β含量明显升高以及PBMC生成IL-1β过多的趋势。在生理情况下,脑内的血管内皮细胞、小胶质细胞、星形细胞和神经细胞均具有合成IL-1的能力。外周血中少量IL-1可经脑室周围组织如正中隆起、终板血管器等进人中枢神经系。IL-1有IL-1α和IL-1β两种亚型,均须与IL-1R结合后才发挥作用。IL-1和IL-1R在中枢神经系统定位于下丘脑和脑干等部位,下丘脑弓状核、室旁核等均有IL-1β的免疫阳性细胞,下丘脑、海马、小脑、大脑皮质等部位均有IL-1R及受体mRNA表达。下丘脑室旁核是HPA轴活动的直接控制部位,IL-1对HPA轴主要是兴奋作用,引起的外周效应为糖皮质类固醇(主要为皮质醇)分泌增加,具体表现为IL-1作用于下丘脑神经元,通过HPA轴引起促肾上腺皮质激素(ACTH)及其前体阿黑皮原mRNA表达,最终血浆糖皮质激素(如皮质酮)升高。IL-1还能抑制下丘脑-垂体-性腺轴功能(HPG),从而抑制促性腺激素诱导的睾酮分泌,表现为血液睾酮含量下降,下丘脑室旁核IL-1R表达升高将有利于IL-1发挥对HPA轴的激活和对HPG轴的抑制作用。本研究结果显示,6周耐力训练引起大鼠下丘脑室旁核IL-1R表达升高,同时耐力训练大鼠血清中皮质酮含量增加、总睾酮含量明显下降,提示下丘脑IL-1R表达升高、血清中IL-1增高及血清皮质酮升高、睾酮下降这些在耐力训练中的改变与IL-1及IL-1R对HPA轴的激活和对HPG轴的抑制作用表现的外周效应一致。本实验关于2种中药多糖的干预研究显示,训练同时补充牛膝多糖或黄芪多糖有防止大鼠下丘脑室旁核I