应激性溃疡中枢调节机制及其与肾上腺皮质轴间关系的研究

应激性溃疡中枢调节机制及其与肾上腺皮质轴间关系的研究

应激（su）是一种急性疾病，以胃粘膜糜烂或浅表性溃疡为特征。在严重的情况下，可以发生胃肠道穿孔和出血。这是严重疾病的常见并发症。目前治疗主要采用抑酸药、抗酸药、黏膜保护剂等,缺乏综合防治的方法。左金丸源自《丹溪心法》,经临床与实验证明它是防治SU的有效名方。本实验中采用改良束缚浸水法制作应激性溃疡动物模型,探讨SU的中枢调节机制及其与丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴系统之间的关系,并观察左金丸的预防作用。1模型制备、检测1.1实验动物分组及模型制备:选用体质量180~220g的健康雄性Wistar大鼠(购自本校实验动物中心,动物合格证号:粤检证字2002A041号),室温22~26℃安静环境下饲养。随机将动物分为6组:正常对照组,应激模型组,左金丸高、中、低剂量组,阳性药物(雷尼替丁)对照组。将实验大鼠禁食24h后,晚0时放入自制大鼠固定器内,调整体位以使其不产生强烈反抗为宜。浸入温度约26℃的水中,水面达剑突处,至6时取出,SU模型即制备完毕。1.2给药方法:左金丸由黄连和吴茱萸组成,低剂量组黄连1.8g/kg,吴茱萸0.3g/kg;高剂量组×4倍剂量,中剂量组×2倍剂量。由第一军医大学南方医院中药房提供,常规煎煮取汁,浓缩,高压灭菌,4℃冰箱保存备用。雷尼替丁(汕头金石制药厂)为312.5g/kg。各药物按比例配制成水溶液,用2ml灌胃;正常组和模型组以2ml生理盐水灌胃。连续给药3d,第3d给药2h后按上述方法制作模型。1.3检测指标及方法1.3.1胃溃疡指数(IU)、胃液pH值:大鼠经腹腔麻醉,结扎幽门,取出胃。由贲门吸取少量胃液,用试纸(购自上海三爱思试剂有限公司,批号20020710)测定pH值。向胃内注入体积分数为4%的多聚甲醛溶液10ml,固定30min后沿大弯剪开、展平,测量溃疡个数和长度,参照Guth法计算IU及溃疡抑制百分率(胃黏膜损伤面积长径<1mm计1分,1~2mm计2分,2~3mm计3分,3~4mm计4分,>4mm即分段测量,全胃得分总和为IU)。1.3.2免疫组化法检测下丘脑室旁核c-fos:从腹主动脉取血后结扎之,经左心室至升主动脉插管,先灌注生理盐水200ml,再灌注含4%多聚甲醛溶液500ml。立即取脑后固定于4%多聚甲醛溶液中4~6h,再移至质量分数为20%的蔗糖磷酸缓冲液中至脑组织块沉底,次日恒冷冠状连续切片,切片厚30μm,取含下丘脑室旁核断面的切片,黏附于经多聚赖氨酸(APES)处理的载玻片上。链霉卵白素(SP)法检测c-fos:c-fos免疫组化试剂盒购自北京中山公司。正常羊血清室温封闭20min,兔抗c-fos抗体(1∶100)4℃孵育12h,0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗;生物素标记羊抗兔IgG(即用型)37℃孵育20min,0.01mol/L的PBS漂洗;辣根过氧化物酶抗标记链霉卵白素复合物(S-A/HRP,即用型)37℃孵育20min,漂洗后用3,3′-二氨基联苯胺(DAB)显色剂呈色。脱水、透明和封片后,奥林巴斯光镜下观察并进行阳性细胞计数。阴性对照以PBS代替一抗。1.3.3原位杂交法检测下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素释放激素mRNA(CRHmRNA):取含下丘脑的室旁核断面切片,经漂洗、消化后,予地高辛标记的CRHcDNA探针42℃反应24h,探针浓度为0.5mg/L;梯度系列标准柠檬酸盐-氯化钠(SSC)漂洗后,加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体,1∶1000稀释,室温反应4h;DAB显色;脱水、透明和封片后,奥林巴斯光镜下观察并进行阳性细胞计数。阴性对照以不含探针的杂交液杂交。CRHmRNA原位杂交试剂盒购自武汉博士德公司。1.3.4放射免疫方法检测血浆皮质醇(CORT)和促肾上腺皮质激素(ACTH):腹主动脉取血,抗凝离心制备血浆,-20℃冻存,操作按照放射免疫试剂盒(均购自美国DSL公司)说明书要求进行。1.4统计学处理:实验结果用SPSS10.0统计软件分析,数据用均数±标准差(ˉx±s)表示。多个样本均数比较用单因素方差分析,两组间均数的比较采用独立样本t检验,显著性水平为P<0.05。2结果2.1左金丸对su大鼠胃粘膜的影响2.1.1组织病理学检测①正常组:剖开胃壁后见胃黏膜光整完好。②模型组:打开腹腔可见胃肠胀气,浆膜层充血水肿;剖开胃壁可见胃内少量淡咖啡色物质,黏膜充血、水肿、糜烂,多处点状或线状出血点和溃疡(以胃体和幽门处多见)。③左金丸组:高、中剂量组胃黏膜表面光滑,仅见散在少量点状出血点,未见其他改变;低剂量组轻度充血水肿,尚存在线状出血点或较小溃疡。④雷尼替丁组:变化类似左金丸高剂量组,仅见少量出血点。2.1.2各组疗效的相关性模型组IU明显高于正常组(P<0.01)。左金丸各剂量组均可减少溃疡的发生率(P均<0.01),而且呈明显的正相关;其中尤以高剂量组的疗效为佳,接近正常组水平(P>0.05)。雷尼替丁组与模型组比较有显著性差异(P<0.01);而左金丸高剂量组与雷尼替丁组无显著性差异(P>0.05)。2.1.3对血清中苯甲酸免疫指标的影响模型组胃液pH值明显低于正常组(P<0.01)。左金丸各剂量组均可抑制胃酸分泌(P均<0.01),但未呈剂量依赖性;其中,高剂量组的疗效为佳,接近正常组水平(P>0.05)。雷尼替丁组与模型组比较有显著性差异(P<0.01);而左金丸高剂量组与雷尼替丁组无显著性差异(P>0.05)。2.2左金丸对小鼠脑室旁核c-fos蛋白表达的影响光镜下观察,c-fos蛋白免疫阳性物质呈棕黄色,位于神经细胞核内。正常组仅在下丘脑室旁核、边缘系统的前扣带回、脑干的蓝斑见到少量淡染的阳性细胞。模型组阳性细胞明显增多、着色加深,以下丘脑室旁核最为密集,主要位于小细胞区;下丘脑视上核、内侧视前区以及丘脑室旁核、杏仁核、蓝斑、孤束核、中缝背核、皮质等部位均不同程度有较强的c-fos蛋白表达,但弱于下丘脑室旁核。光镜下(×400倍)计数5个视野内阳性细胞数并取平均值,模型组下丘脑室旁核内c-fos阳性细胞数明显高于正常组(P<0.01)。左金丸高剂量组可减少下丘脑室旁核内c-fos蛋白的表达,与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。其他各给药组与模型组比较均无显著性差异(P均>0.05)。2.3左金丸对杏仁骨髓内crhmrna表达的影响光镜下观察,CRHmRNA呈大量棕黄色颗粒,聚集在细胞核周围的胞浆内。正常组仅在下丘脑室旁核见到极少量淡染的阳性细胞。模型组阳性细胞明显增多、着色加深,主要分布在下丘脑室旁核小细胞部,以双极或梭形细胞为主;杏仁核的部分区域也存在CRHmRNA阳性细胞。光镜下(×400倍)计数5个视野内阳性细胞数并取平均值,模型组下丘脑室旁核内CRHmRNA阳性细胞数明显高于正常组(P<0.01)。左金丸高、中剂量组可减少下丘脑室旁核内CRHmRNA的表达,与模型组比较均有显著性差异(P均<0.05)。左金丸低剂量组、雷尼替丁组与模型组比较均无显著性差异(P均>0.05)。2.4左金丸对雷尼替丁血浆cort的影响模型组血浆ACTH明显高于正常组(P<0.01)。左金丸高、中剂量组可降低ACTH(P均<0.05),其中高剂量组的疗效为佳,接近正常组水平(P>0.05)。雷尼替丁组与模型组无显著性差异(P>0.05)。模型组血浆CORT明显高于正常组(P<0.01)。左金丸各剂量组均可降低CORT(P均<0.01),其中以高剂量组的疗效为佳,接近正常组水平(P>0.05)。雷尼替丁组与左金丸各剂量组比较均无显著性差异(P均>0.05),与模型组比较也无显著性差异(P>0.05)。P<0.05,△△P<0.012.5血浆acth、cort的与血浆acth、cort的相关性表4下丘脑室旁核内c-fos与CRHmRNA表达呈正相关关系(r=0.737,P<0.01)。血浆ACTH及CORT的升高与胃液pH值均呈负相关关系(r1=-0.493,P<0.05;r2=-0.592,P<0.01)。模型组IU与胃液pH呈明显负相关(r=-0.710,P<0.01)。3讨论3.1模型大鼠c-fos蛋白表达的调节SU为危重疾病的并发症,其发病机制十分复杂,治疗尚缺乏有效措施。目前研究多限于胃黏膜局部神经-体液调节方面,对应激系统的启动因素和中枢调节机制尚缺乏研究。c-fos蛋白作为第三信使,尽管其作用具有多效性和非特异性,但它作为神经元被激活的标志,可有效地用于神经通路追踪和信使传递途径的研究。由于c-fos蛋白表达易受非实验因素的干扰,本实验做到所有实验动物的束缚应激和灌注都在相同的时间段内进行,避免了生物节律的影响;操作特别轻柔,避免不必要的刺激。结果显示,模型组c-fos蛋白在下丘脑室旁核区有强烈表达,与正常组有显著性差异。下丘脑室旁核中的阳性神经元主要位于小细胞区,此区富含CRH,与HPA轴关系密切,提示室旁核在应激反应中具有关键作用。既往有人损毁室旁核导致应激反应基本消失,充分说明c-fos表达和神经元功能变化间的直接关系。同时观察到下丘脑视上核、内侧视前区以及丘脑室旁核、杏仁核、蓝斑、孤束核、中缝背核、皮质等部位均有不同程度的c-fos蛋白表达增强,表明这些核团也广泛参与了SU的神经中枢调节。CRH是诱导ACTH、β-内啡肽和其他阿片黑色皮质素原(POMC)源性肽从垂体前叶释放的主要生理调节因子。在应激源影响下,下丘脑室旁核释放的CRH启动HPA轴,调节应激反应。本研究的结果显示,SU模型组大鼠下丘脑室旁核内CRHmRNA阳性细胞明显增多、免疫反应染色增强,与正常对照组比较有显著性差异,提示应激过程中室旁核内合成大量CRH以适应机体调节的需要;同时杏仁核的部分区域也存在CRHmRNA阳性细胞,说明杏仁核也有可能分泌CRH直接作用于HPA轴,与下丘脑共同构成SU中枢调节的神经环路。此外,SU模型组大鼠下丘脑室旁核内c-fos与CRHmRNA表达呈正相关关系,提示c-fos可能参与调节了CRHmRNA的表达,其机制与HPA轴活性有关。3.2不同给药剂量对东南角缘菌群的影响应激反应的主要特征是以HPA激活为核心的生理反应。本研究结果发现,SU模型组大鼠下丘脑室旁核内CRHmRNA阳性细胞数以及血浆ACTH和CORT均明显高于正常组,表明SU发病过程中HPA轴被激活,发挥着调节作用。有学者认为,当机体处于应激状态时分泌大量的ACTH,使胃液分泌增加,造成黏膜糜烂;类固醇激素分泌增多可抑制表面细胞的更新,对胃黏膜起破坏作用。本研究结果发现,ACTH和CORT升高与胃液pH值均呈负相关关系,支持应激状态下ACTH升高导致胃酸分泌增多、胃液酸度增加、损伤胃黏膜的观点,同时也支持CORT升高破坏胃黏膜屏障的观点。3.3应激对酸钠为等的增加中k目前认为SU的发生涉及胃黏膜保护机制削弱、损伤因素作用相对增强及机体的神经内分泌功能失调等多方面因素。胃酸是最常见的内源性损伤因子,在SU形成过程中起着重要作用。尽管不同应激条件下胃酸分泌量可以增强或减弱,但因胃黏膜屏障功能减弱而导致实际H+逆向弥散的总量增加,参与了溃疡的发生。本实验中模型组胃液pH值明显低于正常组、IU明显高于正常组,且二者呈明显负相关。因此,胃酸在SU发生中的作用不容忽视,这可被各种制酸剂预防和治疗SU的确切疗效所证实。本实验中采用H2受体阻滞剂雷尼替丁防治SU,取得良好效果,与模型组比较有显著性差异,也充分说明通过抑制基础胃酸分泌能够保护胃黏膜。3.4对血清c-fos、crhmna、acth和cort的影响中医传统名方“左金丸由黄连六两(姜汁炒)和吴茱萸一两(盐水泡)组成”。临床及实验研究表明,左金丸对SU有明显的防治作用,能明显对抗各种刺激因素引起的急性胃黏膜损伤,抑制胃黏膜的泌酸功能,抑制内、外源性胃泌素诱导的泌酸、抗幽门螺杆菌感染及抑制小鼠胃排空等。本研究结果显示,左金丸各剂量组均可明显升高胃液pH值,减少溃疡发生率;其中高剂量组可减少下丘脑室旁核内c-fos蛋白的表达,高、中剂量组可减少下丘脑室旁核CRHmRNA的表达;可降低ACTH水平;高、中、低各剂量组可降低CORT水平,其中高剂量组的疗效为佳,接近正常组水平。说明左金丸不仅能够抑制胃酸分泌、升高胃液pH值、保护胃黏膜,还通过减少下丘脑室旁核内c-fos蛋白的表达,抑制HPA轴的激活和活性,下调应激反应强度,从而发挥中枢应激调节作用。雷尼替丁通过竞争性与壁细胞上的H2受体结合