天冬中总皂苷的含量测定

天冬中总皂苷的含量测定

天冬是百合科植物天冬的干燥部位。它对滋阴、润干、清肺和液体发生器也有很好的效果。这是临床上常用的中药之一。现代药理研究发现其具有抗肿瘤、抑菌、抗衰老、镇咳祛痰、抗蚊蝇等药理作用。天冬中含有皂苷类、多糖类和氨基酸类等多种化学成分,其中皂苷类成分,主要包括以菝葜皂苷元、薯蓣皂苷元、雅姆皂苷元等皂苷元为非糖部分的多种甾体皂苷,是天冬中主要有效成分。药理研究也显示天冬中皂苷类成分具有抑菌、抗肿瘤、提高机体免疫能力等药理活性11～33。因此,测定天冬中总皂苷含量对评价天冬药材的质量具有重要意义。2000版中国药典中天冬项下只有水分和醇溶性浸出物的检查,无内在质量控制指标”。显然,现有标准难以客观评价天冬的内在质量。因此,笔者对天冬中总皂苷的含量测定进行了方法学考察,重点考察了样品的不同制备方法及不同显色剂对总皂苷含量测定的影响,尽可能的排除天冬中大量糖类成分的干扰。首次采用分光光度法,选用菝葜皂苷元(Sarsasapogenin,C27H44O3)为对照品,通过高氯酸显色,计算天冬药材中总皂苷的含量,并测定了不同产地天冬及四川内江天冬CAP基地中不同生育期的天冬药材中总皂苷的含量。该实验为考察天冬的内在质量提供了一定的依据。1设备和材料1.1uvns实验PerkinElmer分光光度计(Larabola35UVNISspectrometer);BP2110电子分析天平(德国Sartorius);DSY一2—4孔电热恒温水浴锅(北京爱琦商贸中)。1.2皂苷元对照品,msasap膜天冬样品均由鉴定教研室李敏副教授自行采集并鉴定,见表4;菝葜皂苷元对照品(Sarsasapogenin)(中国药品生物制品鉴定所<定量用>);其余所用试剂均为分析纯。2方法研究2.1对照晶溶液的制备精密称取菝葜皂苷元对照品3mg,置于10ml容量瓶中,加甲醇溶解并定容即得。2.2香草醛乙醇液和硫酸ld因菝葜皂苷元分子中不具共轭结构,不宜用UV检测,故须采用显色剂显色。本实验对4种显色剂(0.2ml香草醛--冰醋酸和0.8ml高氯酸;8%香草醛乙醇液和77%硫酸;高氯酸:94%硫酸)进行了比较,发现用高氯酸在65℃水浴加热显色15min后,取出,立即置冰水浴中15min停止反应,摇匀,随行试剂空白,在200～600nm波长范围内绘制吸收曲线,发现对照品溶液与样品溶液在308～315nm间均有最大吸收峰,且较为稳定,漂移较小,方法简单,故最后确定采用高氯酸在上述条件下显色。2.3检测曲线绘制精密吸取菝葜皂苷元对照品溶液与样品溶液0.8ml,按2.2显色方法显色后,在200～600nm波长范围内绘制吸收曲线,发现菝葜皂苷元在308～31lnm处;样品溶液在309～315nm处显较强吸收,空白溶液在此范围内仅有微弱吸收,经多次扫描后确定测定波长为310nm。2.4吸收值的测定精密吸取对照品溶液0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml于三角瓶中,置水浴中挥干甲醇,加高氯酸10ml,摇匀后同2.2项下显色方法显色,随行试剂空白,在310nm处测定吸收值。以菝葜皂苷元质量(mg)为横坐标,吸收值A为纵坐标,绘制标准曲线,所得数据见表1、图1。经计算得回归方程为;Y=1.7588X-0.0165,r=0.9991,菝葜皂苷元在0.18～0.42mg范围内具有良好的线性关系,因标准曲线为不经过原点,故采用外标两点法测定样品。2.5样品溶液的制备精密称取0.5g药材粉末,置索氏提取器内,加l00ml氯仿脱脂2h,残渣挥去溶剂后,再加甲醇100ml在80℃回流提取至无色,溶液回收甲醇至干,加蒸馏水10ml溶解,用水饱和的正丁醇萃取四次(15ml、10ml、10ml、10ml),合并正丁醇部分,用正丁醇饱和的水洗涤,减压回收至干,残渣用甲醇溶液定容至50ml,制得样品溶液。2.6测定多次的测定取样品按2.2项下方法显色后,每隔10min测定1次,数据见表2。试验结果表明,在1h内同一样品液的测定结果基本稳定,RSD为1.72%。2.7精密度测试定量吸取同一样品液液,共6份,按2.2项下方法显色后测定,数据见表3。试验结果表明,方法的精密度较好,RSD为1.03%。2.8加样回收率测定分别精密称取已测知含量的天冬样品5份。每份重0.5g。分别各加入一定量菝葜皂苷元对照品,按2.5项下方法制备样品溶液,依法测定,计算回收率。结果平均回收率为98.80%,RSD为1.18%。2.9不同产地、不同性别、不同药用部位样品中总皂苷含量的变化精密吸取各样品液,按标准曲线制备项下的方法显色,测定,以菝葜皂苷元(C27H44O3)计算各样品中天冬总皂苷的含量,含量均以干燥品计。本实验共测定了6个不同产地(生长期均为2～3年)和12个不同生育期、不同药用部位样品中总皂苷的含量,结果见表4、表5。由表4可得出:不同产地的天冬药材中总皂苷的含量差别较大。以上四川内江产天冬均为药典收载品种A.cochinchinensis(Lour.)Merr.郭北镇、双风镇为“四川内江天冬规范化种植示范区”试验基地所在地。由表5可得出:天冬中总皂苷的含量随生育期的增长而增大。天冬皮中总皂苷的含量也较高。3讨论3.1开环类哌体皂苷的测量方法对于天冬中甾体皂苷含量测定方法,曾有资料报道。该方法中所用对为天冬皂苷AspIV、AspV、AspVI,国内极难得到,且其选用的Ehrlish试盐酸一对二甲氨基苯甲醛试剂)为开环类甾体皂苷的专属性显色剂,而天冬含皂苷并非全为开环类甾体皂苷,因此上述方法测定范围较狭窄,可行性不高。在与天冬的功能主治相吻合的化学成分不明确的情况下,笔者选用菝葜皂苷元为对照品,通过高氯酸显色,来测定计算天冬中总皂苷的含量,该法简便、准确、灵敏,重现性良好,可用于天冬质量控制及GAP研究。3.2样品溶液制备方法对总皂苷测定的影响样品溶液制备时,笔者根据天冬药材的性质及所含化学成分,参照人参等药材中总皂苷含量测定方法,分别从是否脱脂、水饱和的正丁醇萃取次数及是否用正丁醇饱和的水洗涤等3个方面考察了样品溶液制备方法对总皂苷含量测定的影响。实验结果表明:样品溶液经过氯仿脱脂后,除去非皂苷类的亲脂性杂质,再用甲醇热提,然后用水饱和的正丁醇萃取4次,最后再用正丁醇饱和的水洗涤1次,制得的样品溶液澄清,基本排除了天冬中大量糖类等杂质的干扰,且对皂苷提取完全(萃取4次与萃取5、6次制得的样品所测含量相差极小)。该样品制备方法简单,对实验设备要求不高,适用于一般实验室测定大量样品,尤其适用于天冬药材GAP研究中各项规范化操作规程(SOP)的大量因素的筛选比较,故确定采用2.5样品制备方法。3.